人類腸道發育是一個需要多種細胞類型相互協同的高度復雜的過程。早期發育中環境引發的改變與多種免疫介導的病理學有關，包括炎癥性腸病（IBD）。過往研究報道了早期胎兒腸上皮細胞動力學與 IBD 之間的聯系，提示 IBD 患者的腸上皮中可能重現了類似于胎兒的轉錄程序。因此，解讀腸道發育是預防和治療此類疾病的關鍵一步。

位于成人腸隱窩底部的干細胞（LGR5+），分化形成不同的腸道上皮細胞。在 8 -10  個孕周（PCW）時，胎兒腸道上皮細胞就具備了形成自組織的腸上皮類器官的能力，說明此時胎兒腸道已經存在著 LGR5+ 干細胞。然而，人類上皮細胞亞群和其它粘膜細胞類型之間的相互作用，以及腸絨毛的形成和上皮細胞的動力學還未有詳細的研究。

近日，來自威康桑格研究所及劍橋大學干細胞研究所等單位的聯合研究團隊在 Developmental Cell 期刊發表了題為“Single-cell sequencing of developing human gut reveals transcriptional links to childhood crohn’s disease”的文章。該研究對不同發育階段（胚胎，胎兒和兒童）的人類腸道進行單細胞測序，揭示了與疾病相關的胎兒腸道上皮細胞的組成及其分化狀態。

▲文章發表于 Developmental Cell 期刊

研究者首先對 6~10 PCW 的人胚胎進行解剖處理，對 4 至 12 歲的健康兒童的小腸進行粘膜活檢，將組織樣本分離成單細胞懸浮液，使用 10x Genomics 進行單細胞測序分析。通過對上皮細胞黏附分子（EPCAM）進行磁珠分選來富集腸上皮細胞。該研究共分析了 62,854 個胎兒細胞和 11,302 個兒童回腸末端細胞。結果顯示，三個發育階段（胚胎、胎兒和兒童）均包含七種主要細胞類型，但在細胞組成上卻有顯著差異，如：在胚胎及胎兒樣本中，間充質細胞所占比例和多樣性更為豐富；而在兒童樣本中則以免疫細胞為主，且在發育中的腸道近端比遠端更常觀察到分化的細胞狀態。此外，單個細胞簇的時空分布表明，胚胎 / 胎兒上皮細胞簇根據腸道區域和發育時間點顯著分離，而健康兒童樣本中該現象并不明顯，這些差異突出顯示了在捕獲的時間段內腸上皮的主要發育變化（圖 1）。

圖 1.  胚胎、胎兒和兒童腸道的單細胞圖譜分析，來源：Developmental Cell

為進一步闡明腸上皮主要發育變化潛在的機制和途徑，研究者探究了腸絨毛形成過程中腸上皮細胞類型的變化。首先基于 EPCAM 的表達對胎兒小腸上皮細胞進行聚類分析，鑒定了 11 個類別及其差異表達基因，包括典型的成體干細胞基因高表達類（包含 LGR5，ASCL2 等）和均一祖細胞類（包含 SHH，PLA2G2A，BEX5 等）。結果顯示 10 PCW 時，均一祖細胞數量減少，這與絨毛的出現及 LGR5+ 干細胞、未成熟和成熟的腸細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞的出現相一致。接下來研究者使用 BEX5，LGR5 及 MKI67 作為均一祖細胞的標記，來可視化絨毛形成過程中上皮的變化。結果表明，在胚胎階段，上皮由高度循環的，表達低水平 LGR5 的均一祖細胞組成。此外，研究者利用  scVelo 和 PAGA 軌跡算法研究小腸上皮細胞從胚胎（6-8 PCW）到早期胎兒（9-10 PCW）的細胞分化動力學，結果表明循環上皮經歷了從均一上皮到 LGR5+ 干細胞的轉錄轉變。

圖  2.  人絨毛形成過程中的上皮細胞組成，來源：Developmental Cell

隨后，研究者繼續探究了與人類絨毛形成有關的機制和信號通路。首先定義了小腸和大腸在不同發育時間點間充質細胞豐度的變化，以鑒定在絨毛形成過程中出現或受限制的潛在細胞類型。在取樣時間點，可觀察到間充質間室發生重構，且在小腸區域檢測到 FOXL1+ 成纖維細胞；在 6  PCW 人胚胎中觀察到高表達 PDGFRA 和 FOXL1 / F3 的間充質細胞簇，在 10 PCW 時接近形成的絨毛。之后，利用人類 scRNA-seq 數據，分析確定中胚層細胞、FOXL1+ 成纖維細胞和平滑肌細胞是 hedgehog（HH）信號的主要應答細胞，并進一步確定 FOXL1+ 成纖維細胞與均一祖細胞之間的特異性相互作用是通過 BMP、PDGF、Notch、Wnt 和 FGF 信號通路實現的（圖 3）。

  圖 3.  從人類胚胎上皮向胎兒上皮轉變的細胞間相互作用，來源：Developmental Cell

腸上皮干細胞能夠產生各類細胞亞群，這種特性促進了腸類器官培養模型的發展，這些類器官可以由人類胎兒的腸道細胞產生，為研究上皮細胞內在和外在的發育機制提供了機會。研究者利用 scRNA-seq 技術對正在發育的人類腸道類器官進行檢測分析，并使用來自原始組織的轉錄圖譜對上皮細胞進行分類。結果顯示發育中的腸道中沒有檢測到 Paneth 細胞和任何表達 Wnt3a 的間充質細胞。之后，在有無 WNT3a 條件培養基的情況下培養腸上皮器官（IEO），結果顯示，在 WNT3A 存在下培養的類器官含有更多的分化細胞類型，包括腸上皮細胞和腸內分泌細胞。此外，研究發現在培養物中保存了數月的類器官含有增加比例的分化細胞亞群以及數量增加的 LGR5 + 細胞，這表明當前的腸道培養條件選擇了高度增殖的細胞（圖 4）。

圖 4.  胎兒腸道類器官培養，來源：Developmental Cell

研究者對克羅恩病（CD）兒童患者進行 scRNA-seq 末端回腸活檢，探究腸上皮成分、功能和細胞動力學變化對 CD 發病機制的影響。結果顯示，CD 與對照樣本的上皮細胞組成有顯著差異，其中轉運擴增細胞、杯狀細胞和簇狀細胞顯著增加，且 CD 上皮中完全分化的腸細胞比例顯著降低。研究人員同時鑒定出了大量 CD 不同細胞類型之間特異性的相互作用。與健康兒童相比，CD 患者杯狀細胞和 S4 成纖維細胞的 TNFSF10-TNFRSF10B 信號的特異性降低，而腸上皮細胞的特異性保持不變。研究者確定了 CD 和發育中的上皮細胞之間共有的轉錄因子，為 CD 上皮細胞中發育性轉錄通路的部分重新激活提供了支持性證據。

圖 5.  來人腦或人腦器官的 scRNA-seq 數據及每個基因模塊內基因表達，來源：Developmental Cell

綜上所述，該研究提供了人類胚胎、胎兒和兒童健康腸道以及炎癥性腸道疾病的單細胞圖譜，剖析了腸道生命過程中上皮細胞動態的轉錄變化。研究同時將數據整理發布在 http://www.gutcellatlas.org/，提供了交互式探索數據的資源。

參考文獻：

Elmentaite R, Ross ADB, Roberts K, et al. Single-Cell Sequencing of Developing Human Gut Reveals Transcriptional Links to Childhood Crohn's Disease. Dev Cell. 2020 Dec 1. DOI: 10.1016/j.devcel.2020.11.010. 

轉載：測序中國（侵刪）

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