單細(xì)胞基因表達(dá) Flex 是 10x Genomics 于 2022 年 3 月推出的新產(chǎn)品（原 Fixed RNA），通過(guò)探針雜交的方式捕獲靶基因，再進(jìn)行細(xì)胞捕獲建庫(kù)測(cè)序的新技術(shù)。該技術(shù)可鎖定 RNA 的瞬時(shí)表達(dá)狀態(tài)，解決了單細(xì)胞樣本儲(chǔ)存運(yùn)輸、多樣本批量處理以及混樣測(cè)序的問(wèn)題，讓單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究更加靈活。

針對(duì) FFPE 切片，使用二甲苯脫蠟，使用膠原酶、胰蛋白酶等多種酶來(lái)消化組織，制備單細(xì)胞懸浮液，進(jìn)而抽核得到細(xì)胞核樣本；建庫(kù)時(shí)采用靶向基因的探針對(duì)雜交目標(biāo) RNA 分子后連接的原理，進(jìn)而完成文庫(kù)構(gòu)建的過(guò)程；該方法可以用來(lái)分析數(shù)千個(gè)至數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞核的基因表達(dá)，能夠?qū)θ嘶蛐∈蟮?FFPE 樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。

單細(xì)胞基因表達(dá) Flex 是基于探針雜交原理，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是對(duì)已知序列設(shè)計(jì)探針，然后將成對(duì)的探針與 RNA 進(jìn)行原位雜交，之后對(duì)探針進(jìn)行擴(kuò)增，然后用 Gel Beads 捕獲探針進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。

 ▲上圖 單細(xì)胞基因表達(dá) Flex 的探針雜交原理

首先，將 FFPE 樣本制備成細(xì)胞核懸液，然后加入探針進(jìn)行探針的雜交。如果是多樣本混樣，則需要在雜交后對(duì)樣本進(jìn)行等細(xì)胞數(shù)量的混合。混合計(jì)數(shù)之后取一定數(shù)量的細(xì)胞懸液進(jìn)行上機(jī)捕獲，在 PCR 儀中進(jìn)行探針的連接和延伸。隨后進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序到最后的數(shù)據(jù)分析。

▲上圖   單細(xì)胞基因表達(dá) Flex 工作流程

單細(xì)胞 RNA 測(cè)序研究的范圍和規(guī)模正在不斷擴(kuò)大，研究人員的目標(biāo)是根據(jù)患者隊(duì)列或多個(gè)治療條件或時(shí)間點(diǎn)來(lái)分析更多的樣本。Chromium 單細(xì)胞基因表達(dá) Flex 分析不僅能對(duì)新鮮樣本開(kāi)展單細(xì)胞基因表達(dá)分析，還能對(duì) PFA 固定樣本及 FFPE 細(xì)胞和組織進(jìn)行分析。尤其是 Flex 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 FFPE 樣本在單細(xì)胞水平的研究，可以解鎖大量?jī)?chǔ)存在醫(yī)院以及生物樣本庫(kù)中的 FFPE 樣本的寶貴信息。

（1）擴(kuò)大了樣本范圍：能對(duì) FFPE 細(xì)胞和組織，以及 PFA 固定樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析，而不再受限于是否有新鮮組織可用，可以解鎖大量?jī)?chǔ)存在醫(yī)院以及生物樣本庫(kù)中的 FFPE 樣本的寶貴信息。

（2）簡(jiǎn)化了工作流程：FFPE 樣本比較容易獲取，易運(yùn)輸，并且樣本收集相對(duì)經(jīng)濟(jì)成本低。使樣本采集更加靈活，實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排更加方便。

（3）提升了低表達(dá)基因檢測(cè)靈敏度：根據(jù) Flex 和單細(xì)胞 3RNA 的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比結(jié)果，在多種樣本類(lèi)型中，相同的測(cè)序數(shù)據(jù)量下，F(xiàn)lex 所得的測(cè)序數(shù)據(jù)飽和度更高，探針靈敏度更強(qiáng)，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到的基因數(shù)更多。

（4）與 10x Visium FFPE 空間轉(zhuǎn)錄組更配：Flex 技術(shù)與 10x 推出的 FFPE 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)完美結(jié)合，能夠通過(guò)同一套探針對(duì)同一 FFPE 樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與空間轉(zhuǎn)錄組研究，基因表達(dá)一致性更高，數(shù)據(jù)聯(lián)合分析匹配性更好。

由于需要捕獲探針捕獲基因進(jìn)行建庫(kù)，因此需要有配套的探針的物種才可以開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。目前單細(xì)胞 Flex RNA 僅適用于人類(lèi)和小鼠，并且只能進(jìn)行基因表達(dá)應(yīng)用（不能進(jìn)行 ATAC-Seq 或 VDJ 測(cè)序）。對(duì)于 FFPE 樣本，由于受蠟塊年齡、組織類(lèi)型、固定前組織質(zhì)量、組織密度、組織面積以及其他因素的影響，致使相同面積和厚度的組織解離后獲取的細(xì)胞數(shù)量也會(huì)存在較大差異。

1、FFPE 樣本量要求

石蠟塊： 蠟塊被包埋組織體積需要 >0.5cm³

石蠟卷： 厚度 25μm 或 50μm 石蠟卷 3 卷以上，不可小于 25μm；被包埋組織橫截面積需 >0.3 cm² 蠟卷完整不破碎，放入 1.5ml EP 管中，4 度避光保存和運(yùn)輸。石蠟卷如破碎較為嚴(yán)重，說(shuō)明樣本脆性較大，會(huì)影響樣本質(zhì)量。注：某些組織類(lèi)型由于同等體積下細(xì)胞數(shù)量較少，可能需要提供更多蠟卷，例如穿刺樣本、脂肪組織、肺癌、心肌等。

FFPE 保存年限：無(wú)明確年限要求，10x Genomics 已測(cè)試過(guò)長(zhǎng)達(dá) 11 年的樣本；已有文獻(xiàn)表明相對(duì)于保存時(shí)間，固定時(shí)間對(duì) RNA 質(zhì)量影響更大（Trinks A，2024；Yunxia Guo，2023）。

2、FFPE 組織切片的細(xì)胞產(chǎn)量

在單個(gè)孔中可以檢測(cè)多達(dá) 10,000 個(gè)細(xì)胞 / 核，即每個(gè)芯片最多可檢測(cè) 80,000 個(gè)細(xì)胞。然而，裝載的細(xì)胞或細(xì)胞核越多，可能出現(xiàn)的多胞率就越多。此外，更多的細(xì)胞意味著需要更高的測(cè)序數(shù)據(jù)量。一個(gè)常見(jiàn)的目標(biāo)是每孔 8000 個(gè)細(xì)胞 / 核。10x 給出了一個(gè)樣本準(zhǔn)備推薦表，給出了樣本類(lèi)型，石蠟卷張數(shù)和橫切面面積，以及相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞核得率。在這個(gè)表的基礎(chǔ)上可以預(yù)估一下需要的蠟卷數(shù)量和厚度，最后兩列細(xì)胞核的數(shù)量是 10x 用他們自己的方法做出來(lái)的細(xì)胞得率，伯豪生物用的是自己研發(fā)的方法抽核，細(xì)胞核得率和質(zhì)量更有保證。

圖 10x 給出的特定組織類(lèi)型 / 切片的近似細(xì)胞產(chǎn)量

3、FFPE 組織核酸質(zhì)量要求

核酸質(zhì)檢需要 DV200>30%（DV200 指長(zhǎng)度大于 200nt 的 RNA 片段占總的 RNA 片段的比例）

4、FFPE 樣本細(xì)胞核懸液的質(zhì)控要求

因?yàn)橐M(jìn)行探針雜交，雜交結(jié)束要洗好幾遍，中間會(huì)損失很多細(xì)胞核。所以單細(xì)胞核懸液中的細(xì)胞核總數(shù)量要大于 30 萬(wàn)個(gè)，而且核膜完整度 >80%，結(jié)團(tuán)率 <10%。除此，還要求抽核后背景干凈雜質(zhì)少，雜質(zhì)多的話會(huì)拉低中位基因數(shù)同時(shí)會(huì)有游離 RNA 的污染。

▲上圖 解離后（左）和雜交后洗滌后的細(xì)胞計(jì)數(shù)（雜交后洗滌可減少碎片）

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