腫瘤內(nèi)異質(zhì)性對(duì)癌癥患者的準(zhǔn)確診斷和建立個(gè)性化治療策略帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)。這種異質(zhì)性可能是治療耐藥性、疾病進(jìn)展和癌癥復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)。為了提高免疫治療效果， 研究人員使用 空間轉(zhuǎn)錄組 技術(shù)（spatial transcriptome，ST) 來(lái)識(shí)別，阻斷腫瘤異質(zhì)性的來(lái)源，提供識(shí)別新的生物標(biāo)志物的能力，并深入了解腫瘤細(xì)胞、脂肪組織、血管、三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)和 TME 間基質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)相互作用。 目前多項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于癌癥組織內(nèi)的這種分析，包括，原位雜交，數(shù)字空間分析以及一種新興技術(shù)的 10×Genomics Visium 空間基因表達(dá)解決方案。10×Genomics Visium 產(chǎn)生定量基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并將它們映射到組織結(jié)構(gòu)上。通過(guò)保留空間信息可以很好地識(shí)別新的生物標(biāo)志物，該技術(shù)可能會(huì)影響新的組合免疫療法。

多重免疫組化 / 免疫熒光（mIHC/IF) 是一種常用的工具，可同時(shí)檢測(cè)單個(gè)組織樣本中多達(dá) 40 個(gè)感興趣的標(biāo)記物。與單獨(dú)分析腫瘤突變負(fù)荷（TMB) 或基因表達(dá)譜（GEP) 相比，這種方法能更好地預(yù)測(cè)細(xì)胞對(duì) PD-1/PD-L1 治療的反應(yīng)。

下面為大家介紹幾種空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，及各種技術(shù)的特點(diǎn)：

01、 原位雜交技術(shù)（In Situ Hybridization，ISH）

原位雜交（ISH) 是一種在細(xì)胞或組織中可視化特定 DNA 或 RNA 分子的分子技術(shù)。ISH 是基于互補(bǔ)性質(zhì)的 DNA/DNA 或 DNA/RNA 雙鏈和標(biāo)記核酸探針的原位雜交到靶序列上。通過(guò)這種方式，我們可以獲得有用的空間信息。傳統(tǒng)方法，核酸探針附著在放射性標(biāo)簽上。目前這種方法已被螢光顏料所取代。也就現(xiàn)在大家所熟知的熒光原位雜交技術(shù)（FISH）。FISH 本身已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)展成為一種被稱為多重單分子 FISH (smFISH) 的技術(shù)，它能夠在單分子分辨率下同時(shí)檢測(cè)大約 10,000 個(gè)基因和每個(gè)細(xì)胞大約 70,000-100,000 個(gè) RNA 分子。下面為大家概述每種技術(shù)的基本原理：

熒光原位雜交（FISH）

FISH 是檢測(cè)微生物、診斷實(shí)體癌癥和血液癌癥以及指導(dǎo)癌癥治療的有用的臨床工具。例如，F(xiàn)ISH 已被常規(guī)用于檢測(cè)慢性髓系白血病中的 BCR-ABL1 t(9;22) 易位和各種癌癥中的許多融合基因。FISH 還被用于確認(rèn)乳腺癌中的人表皮生長(zhǎng)因子受體 2  (HER2) 基因擴(kuò)增，從而識(shí)別有可能從曲妥珠單抗（一種針對(duì) HER2 的單克隆抗體治療）中獲益的患者。隨著更多免疫療法的開(kāi)發(fā)和批準(zhǔn)，研究人員已經(jīng)尋求使用 FISH 來(lái)預(yù)測(cè)癌癥免疫治療的反應(yīng)性。為了擴(kuò)大 FISH 的有效性，將 FISH 與 IHC 或 IF 結(jié)合，同時(shí)檢測(cè)不同細(xì)胞類型的 RNA 和蛋白質(zhì)，可以更好地來(lái)表征 TME。

Single-Molecule FISH（smFISH）和 RNAscope

為了解決傳統(tǒng) FISH 的局限性，研究工作已經(jīng)從 DNA 研究轉(zhuǎn)向了單分子 RNA 的研究，并且使用高通量的方法。由此產(chǎn)生的技術(shù)，稱為單分子 FISH (smFISH)，允許研究人員可視化和量化單個(gè) mRNA 分子，并表征內(nèi)源性基因表達(dá)的空間模式。

RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA) 是一種商業(yè)化的基于 ISH 的技術(shù)，使用分支 DNA 和信號(hào)放大實(shí)現(xiàn)比傳統(tǒng) FISH 更好的靈敏度和特異性：通過(guò)這種方法，研究人員可以在抑制背景噪聲的同時(shí)檢測(cè)和量化低含量的 mRNA。這種方法可以檢測(cè)多達(dá) 12 種不同的 RNA 靶點(diǎn)，可以方便地與免疫組化和 / 或 IF 結(jié)合，以自動(dòng)化的方式同時(shí)研究 RNA 和蛋白質(zhì)。RNAscope 相對(duì)于其他基于 FISH 的技術(shù)的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是，13000 個(gè) RNA 探針已經(jīng)被設(shè)計(jì)并通過(guò)商業(yè)建立的協(xié)議進(jìn)行驗(yàn)證；因此，它是一種用于研究和臨床實(shí)驗(yàn)室的省時(shí)和友好的方法。通過(guò)檢測(cè)一種感興趣的特定 RNA, RNAscope 已經(jīng)揭示了 TME、免疫逃逸機(jī)制和新的預(yù)測(cè)和預(yù)后癌癥生物標(biāo)志物。

Multiplexed smFISH

雖然研究人員可以通過(guò) RNAscope 等技術(shù)獲得更高的敏感性和特異性，但需要一種基于 FISH 的高通量轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)來(lái)更好地表征具有獨(dú)特基因表達(dá)譜的罕見(jiàn)細(xì)胞群和細(xì)胞類型。比如多重糾錯(cuò) FISH(MERFISH) 和序列 FISH(seqFISH)，不僅提供了改進(jìn)的 RNA 定量、信號(hào)放大和檢測(cè)，而且更重要的是，提供了基于圖像的轉(zhuǎn)錄組分析。

MERFISH 由 smFISH 改良而來(lái)，采用基于條形碼的組合標(biāo)記方法，隨后進(jìn)行多輪雜交，以確保高水平的熒光信號(hào)亮度和可同時(shí)檢測(cè)到的大量 RNA (圖 1)。MERFISH 可以實(shí)現(xiàn)接近全基因組分析和 90% 的檢測(cè)效率，在人類骨肉瘤細(xì)胞中已經(jīng)證明。與傳統(tǒng)的 FISH 相比，MERFISH 還提供了額外的好處，即能夠以低豐度量化單個(gè) RNA 分子。

圖  MERFISH 原理

seqFISH 是另一種多重 smFISH 技術(shù)，它是基于連續(xù)多輪的條形碼雜交標(biāo)記技術(shù)。它可以提供亞衍射極限的空間分辨率，優(yōu)于其他 RNA 分析技術(shù)。例如，seqFISH 對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞和腦組織中的 10000 種 mRNA 進(jìn)行了高精度、高分辨率的成像。Zhou 等人證明 seqFISH 是一個(gè)研究和獲得 t 細(xì)胞成熟過(guò)程中調(diào)控基因表達(dá)動(dòng)態(tài)的強(qiáng)大工具。Voith von Voithenberg 等人將微流體技術(shù)與多路 smFISH 相結(jié)合，研究乳腺癌中的腫瘤異質(zhì)性。

圖  seqFISH 原理

smFISH 和多重 smFISH 是單細(xì)胞 RNA 測(cè)序研究和量化細(xì)胞 RNA 的替代方案，因?yàn)樗峁┝藛渭?xì)胞甚至單分子水平上的亞細(xì)胞空間信息。然而，盡管基于 smFISH 的多重技術(shù)很有前景，但由于復(fù)雜的探針設(shè)計(jì)、驗(yàn)證、圖像分析和解碼，它還沒(méi)有廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)化研究或臨床設(shè)置。通常使用非多重 FISH、定量 PCR、免疫組化、IF 等方法在 mRNA 或蛋白水平上研究單個(gè)基因表達(dá)更為方便，特別是當(dāng)研究的基因數(shù)量較小時(shí)，如一套預(yù)后標(biāo)志物。另一個(gè)限制是，與其他技術(shù)相比，因?yàn)樾蛄须s交，成像時(shí)間加起來(lái)至少 18 h，還不包括 36-48 h 的探針雜交時(shí)間，導(dǎo)致整體的通量較低  (表）。此外，多重 smFISH 技術(shù)只能評(píng)估新鮮冷凍組織中一種類型的分析物，如 RNA。新興的技術(shù)，如數(shù)字空間分析，可以評(píng)估新鮮冷凍組織和病理醫(yī)師經(jīng)常使用的標(biāo)準(zhǔn)福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE) 組織中的蛋白質(zhì)和 RNA 水平。

表：多種空間轉(zhuǎn)錄成像技術(shù)對(duì)比

02、 空間轉(zhuǎn)錄組（Spatial Transcriptomics，ST）

在單細(xì)胞 RNA 測(cè)序過(guò)程中，空間信息丟失。盡管該技術(shù)被廣泛用于探索單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜，但它的捕獲效率和測(cè)序覆蓋率較低，以及高丟失率，這些都可能影響后續(xù)數(shù)據(jù)的分析和解釋。

隨著一家名為“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)”（Spatial Transcriptomics，Stockholm, Sweden) 的公司率先開(kāi)發(fā)的技術(shù)的發(fā)展，空間基因組學(xué)這一新興領(lǐng)域進(jìn)入了人們的視線。該技術(shù)利用空間條形碼寡脫氧胸腺嘧啶微陣列實(shí)現(xiàn)完整組織切片中的轉(zhuǎn)錄組定量可視化和分析。在進(jìn)行 RNA 測(cè)序過(guò)程之前，將獨(dú)特的位置條形碼引入玻片，以保持組織結(jié)構(gòu)中的空間位置。

圖 Visium Spatial Gene Expression Solution 原理

這項(xiàng)新技術(shù)首先在小鼠嗅球上進(jìn)行，包括組織包埋，組織切片、固定、蘇木精和伊紅（H&E) 染色、亮視野成像、組織通透化、cDNA 合成、組織移除、探針釋放、文庫(kù)準(zhǔn)備、測(cè)序、數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)可視化和分析。值得注意的是，該工作流程的一個(gè)顯著特征是能夠生成帶有保留空間信息的載玻片 cDNA 文庫(kù)，使其能夠可視化地將基因表達(dá)譜映射到相應(yīng)的組織形態(tài)。

目前該技術(shù)已經(jīng)用于多種疾病類型，包括研究人員在乳腺癌、前列腺癌和皮膚惡性黑色素瘤活檢中發(fā)揭示了腫瘤內(nèi)部及之間的異質(zhì)性，以及癌和癌旁間差異的基因表達(dá)譜。當(dāng)然，組織病理學(xué)注釋和單細(xì)胞 RNA 測(cè)序可以分別識(shí)別異常的組織形態(tài)和確認(rèn)存在遺傳上不同的細(xì)胞群；然而，ST 可以根據(jù)基因表達(dá)譜來(lái)識(shí)別不同的空間區(qū)域。 基于空間轉(zhuǎn)錄組公司首創(chuàng)的概念，10X genomics 公司發(fā)布了 Visium Spatial Gene Expression Solution (10×Genomics, USA)，與第一代 ST 技術(shù)相比，Visium Spatial Gene Expression Solution 具有更高的分辨率和更高的靈敏度。 為了進(jìn)一步挖掘 ST 的潛力，研究人員近開(kāi)發(fā)了一種被稱為多模態(tài)交叉分析（MIA) 的分析方法。MIA 結(jié)合了單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和 ST 技術(shù)生成的數(shù)據(jù)集，可以將細(xì)胞定位到組織上特定的區(qū)域。

盡管 10X genomics 公司發(fā)布了 Visium Spatial Gene Expression Solution 為科學(xué)研究帶來(lái)了很大的希望，但它仍然有局限性。 首先，盡管官方推薦的組織切片厚度是 10μm，但是這個(gè)值還要取決于組織類型和成分。10×Genomics 提供了一個(gè)支持網(wǎng)站，上面提供了兼容組織和相應(yīng)厚度的更新列表。到目前為止，已經(jīng)列出了 4 種大鼠組織、20 種小鼠組織和 19 種人類組織，還有 4 種組織計(jì)劃進(jìn)一步優(yōu)化。此外，10×Genomics 還被建議對(duì)每一種新的組織類型進(jìn)行一次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榻M織通透性條件在組織、物種甚至實(shí)驗(yàn)室之間是不同的。其次，Visium 僅在新鮮冷凍標(biāo)本中得到驗(yàn)證，針對(duì)于 FFPE 標(biāo)本的解決方案也會(huì)在不久后推出。每個(gè)組織捕獲區(qū)域包含~ 5000 個(gè) spot 點(diǎn)，根據(jù)組織類型和厚度的不同，每個(gè)點(diǎn)可以捕獲 1 -10 個(gè)細(xì)胞。 雖然有些人可能認(rèn)為這項(xiàng)技術(shù)令人滿意，但在需要獲得詳細(xì)細(xì)胞類群信息時(shí)仍需要做額外的工作。先進(jìn)的解決方案是將 MIA 分析方法集成到分析工作流中，以允許在細(xì)胞級(jí)別進(jìn)行識(shí)別。盡管存在這些限制，但由于 visium 可以迅速識(shí)別基因表達(dá)譜，并在不丟失空間信息的情況下檢測(cè)出癌癥起始和進(jìn)展的新特征， 因此 10×Genomics visium 技術(shù)是目前有潛力及前景的技術(shù) 。

參考文獻(xiàn)：

Nerurkar S N, Goh D, Cheung C C L, et al. Transcriptional Spatial Profiling of Cancer Tissues in the Era of Immunotherapy: The Potential and Promise[J]. Cancers, 2020, 12(9): 2572.

更多伯豪生物人工服務(wù)：