1、腫瘤微環境；

2、自身免疫性疾病；

3、感染性疾病；

4、器官、骨髓移植；

5、抗體開發。

1、肝癌免疫微環境

2017 年，北京大學張澤民教授課題組通過大規模單細胞測序技術對肝癌相關 T 淋巴細胞進行了分析，在單細胞水平上描繪肝癌微環境中免疫圖譜。研究者收集了 6 例肝癌患者的外周血，癌旁正常組織、肝癌組織作為實驗樣本，然后從各類樣本中用流式分選出 CD3+CD8+（cytotoxic T cells，Tc）細胞，以及 CD4+CD25-（Helper T cells，Th）細胞和 CD4+CD25+（regulatory?T cells，Tregs）細胞，并進行了單細胞轉錄組測序和單細胞 TCR 測序，總共獲得 5063 個單細胞的數據。其中，單細胞水平分析 TCR 序列發現，在腫瘤侵潤的 exhausted T 細胞和 Tregs 細胞中，觀察到 TCRs 發生了重復使用。在腫瘤組織中含有相同 TCR 的 T 細胞比例較高，而在外周血和正常組織中比例較低，這說明在腫瘤中的 exhausted T 細胞和 Tregs 細胞發生了克隆擴增。并且相比于早期病人，晚期病人中 T 細胞的克隆擴增更加明 顯。

圖 肝癌中 T 細胞的克隆擴增

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2、黑色素瘤免疫微環境

2019 年發表在 Cell 上發表的一篇論文，對 25 個黑色素瘤患者腫瘤中總共 46,621 個免疫細胞進行了單細胞 RNA 和 TCR 測序。這些細胞被分成 7 個大群，包括 T 細胞（CD3），NK 細胞（KLRD1），樹突細胞（DCs；CD1C），巨噬細胞（C1Q），單核細胞（VCAN），B 細胞（CD19），和漿細胞（immunoglobulins）。初始 T 細胞高表達 IL7R, CCR7 和轉錄因子 TCF7，特異性表達的基因整體來說比其它類型的細胞少。而非初始 T 細胞具有很高的異質性，其中一小群是記憶 T 細胞，大部分細胞是過渡性 CD8 T 細胞（transitional CD8 effector T），細胞毒性 CD8 T 細胞（cytotoxic CD8 effector T）和喪失功能的 CD8 T 細胞（dysfunctional CD8 T cells），高表達 PD- 1 和 LAG3。這些細胞類群的邊界是模糊的，提示轉錄的梯度表達是造成 T 細胞異質性的原因。CD4 T 細胞主要有高表達 FOXP3 的 Treg，濾泡輔助 T 細胞（CXCL13 表達），以及一小群高表達免疫檢查點分子的細胞（dysfunctional CD4 T cells）。分析每名患者的免疫細胞組成，發現大部分 T 細胞類群在患者中都存在，但是病人之間不同細胞類群的豐度有很大差異。喪失功能的 CD8 T 細胞的負荷可能是黑色素瘤本質的特征。

圖 病人間免疫微環境異質性

通過分析 T 細胞的 TCR 序列，發現不同病人的 TCR 克隆型構成差異較大。一些大的克隆中細胞類型也不同，主要表現為喪失功能的 CD8 T 細胞的富集和初始 T 細胞的缺失。患者中喪失功能的 CD8 T 細胞的比例與 T 細胞的擴增程度呈現正相關。通過計算每個細胞的增殖分數，發現喪失功能的 CD8 T 細胞有高增殖細胞比例，比初始 T 細胞高出 10 倍。

圖 黑色素瘤中 T 細胞的克隆擴增

3、免疫治療

靶向 PD-1/PD-L1 通路的免疫檢查點抑制劑的出現，給癌癥的臨床治療帶來了革命性的變化。然而 人們對 PD-1 抗體的抑癌機制并不了解。其中一個關鍵的問題是 PD- 1 抗體的抑癌效果，究竟是依賴于在治療前就存在于腫瘤中的浸潤淋巴細胞的再激 活，還是治療之后，腫瘤外的殺傷 T 細胞進入腫瘤？這個問題，目前也是不清楚的。來自斯坦福大學醫學院的研究團隊，從接受 PD- 1 抗體治療前后的基底細胞癌（BCC）或鱗狀細胞癌（SCC）患者身上采集了 79046 個細胞（包括癌細胞和各種免疫細胞），進行了單細胞 RNA 測序和 TCR 測序。基于單細胞 RNA 測序結果，細胞分成 19 個亞群。

本研究的重點是免疫細胞，尤其是浸潤性免疫細胞，以及治療前后的變化，以了解克隆性 T 細胞對 PD- 1 抗體治療的反應。因此研究人員把所有的 33106 個腫瘤浸潤性 T 細胞做了個更細致的分類，包括表達 CD4 的調節性 T 細胞（Treg）細胞，濾泡輔助性 T（TFH）細胞，T 輔助細胞 17（TH17）細胞；以及表達 CD8 的幼稚細胞，記憶 T 細胞，效應記憶 T 細胞，活化 T 細胞，慢性活化 / 耗竭 T 細胞，中度耗竭 / 活化細胞。進一步分析發現，在 PD- 1 抗體治療之后，濾泡輔助性 T 細胞，以及活化，耗竭和耗竭 / 活化的 CD8 陽性 T 細胞的頻率增加，并且耗竭 T 細胞的克隆水平明 顯更高。更為讓研究人員感到意外的是，對于同一個患者而言，治療后記憶 T 細胞和效應 T 細胞頻繁轉換為活化狀態，但是治療前的耗竭 T 細胞卻沒有變成治療后的非耗竭表型。這表明，即使在 PD- 1 抗體治療后，已經耗竭的腫瘤浸潤 T 細胞也很難變成活化狀態了。

圖 治療前后 T 細胞的狀態轉換。

此外，研究人員還觀察到一個有趣的現象，PD- 1 抗體治療后才出現的耗竭性 T 細胞表現出了新的 TCR 特異性。為了分析外周血中是否存在新發現的腫瘤浸潤性 T 細胞，研究人員給患者的血液樣品做了 TCR 測序，發現 35.5% 新腫瘤浸潤性 T 細胞可以在 PD- 1 抗體治療后的外周血中找到，而在治療前的外周血中只能找到 11.8% 的新腫瘤浸潤性 T 細胞，不過治療前的腫瘤里面卻沒有新腫瘤浸潤性 T 細胞。

圖 新發現的腫瘤浸潤性 T 細胞在外周血中的比例

總的來說，與“冷”腫瘤相比，“熱”腫瘤之所以響應 PD- 1 抗體的治療，可能是由于“熱”腫瘤自身的特性，讓它能夠不斷吸引新 T 細胞進入，而不是重新激活已有的腫瘤浸潤性 T 細胞。這項研究讓我們對免疫檢查點抑制劑的作用機制有了新的認知，這對臨床治療和療效的檢測都有一定的價值和意義。

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