伯豪生物官網 www.www.isoye.cn 單細胞 ATAC 測序技術服務來了！

單細胞 ATAC 測序（Aaasay for transposase Accessible Chromatin with high throughput sequencing at the single cell level）翻譯成中文是在單細胞水平上通過高通量測序技術來研究染色質開放程度（也叫染色質的可及性）。染色質開放程度（染色質的可及性），反映了染色質的轉錄活性狀態，是研究基因表達調控的重要方向，在表觀遺傳圖譜繪制、細胞分化和發育及各類疾病的發生發展研究中具有重要的作用。

對染色質可及性的研究是伴隨著對染色體結構研究的發展逐漸興起的。1971 年，Mirsky 首先使用 DNase 來研究染色質的結構，發現 DNase 對于存在與染色中的 DNA 仍然可以切割，表現出染色中的 DNA 對于 DNase 的可及性。1975 年，Burkholder 和 Weaver 研究發現 DNase I 對舒展狀態的染色質的消化速率高于對壓縮狀態的染色質。同時指出 DNA 與染色質蛋白的結合程度的差異與這兩種狀態下染色質片段的功能相關。目前人們已經知道雙螺旋的 DNA 與組蛋白結合后，會以染色質或染色體的形式形成高級空間結構。以人的基因組為例，每個組蛋白八聚體上纏繞有 146 個堿基對的 DNA。連接核小體與核小體之間的 DNA 序列稱為連接序列。活細胞中染色質的結構總是處在動態變化中，在不同類型的細胞中，或在不同的生理條件和外界刺激下，細胞核中染色中呈現不同的結構和狀態。這些結構和動態變化的狀態表現形式之一就是染色質可及性的變化。

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2015 年 4 月，Science 發表了 Multiplex single-cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing [1] 的文章。同年 7 月，Nature 發表了 Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation [2] 的文章。這兩篇論文先后提出利用單細胞 ATAC-seq 技術對染色質可及性進行檢測，探索細胞轉錄調控機制，解決了以往存在的細胞異質性難題，成為 ATAC-seq 技術的一大突破。其中，后者將 ATAC-seq 與 Fluidigm C1 單細胞平臺整合，利用微流控芯片完成捕獲、裂解、轉座、PCR 等實驗過程，建立了自動化的單細胞染色質可及性圖譜研究方法。

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圖 ATAC-seq 與 Fluidigm C1 單細胞平臺整合的實驗流程 [2]

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作者首先對 254 個類淋巴母細胞進行了單細胞 ATAC 測序，將這些單細胞數據合并分析后得到的結果與群體細胞 DNase-seq 或 ATAC-seq 獲得的染色質可及性圖譜具有很高的相關性，單細胞水平的數據再現了一些群體細胞 ATAC-seq 數據反映出的染色質特征。

圖 單細胞 ATAC-seq 與常規 ATAC-seq 的一致性 [2]

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為了進一步驗證方法的可靠性，作者又用 scATAC-seq 的方法對 ENCODE 細胞系，包括 H1 人類胚胎干細胞、K562 慢性粒細胞性白血病細胞、GM12878 類淋巴母細胞、V6.5 小鼠胚胎干細胞、EML1 細胞（小鼠造血祖細胞）、TF- 1 細胞（人類成紅細胞）、HL-60 cells（人類 ?promyeloblasts）和 BJ 成纖維細胞 HL-60 細胞進行了分析。結果發現在增殖細胞中，復制時序結構域（replication timing domains）的染色質可及性的變異性增加。同時，作者還發現不同的轉錄因子可以通過協同或者競爭性結合的作用促進或者抑制染色質可及性的可變性。通過此方法對作者對大量轉錄因子的 ChIP-seq 數據研究繪制出了轉錄因子協同作用改變染色質可接近性的圖譜。此外，還發現與高可變性相關的轉錄因子的是細胞類型特異的，在單細胞中染色質狀態與組蛋白修飾也與染色質可接近性變化相關。

圖 轉錄因子通過協同或者競爭性結合作用促進或者抑制染色質可及性的可變性 [2]

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2018 年 10 月，10X Genomics 推出的 Chromium 單細胞 ATAC 解決方案提供了一種全面的、可擴展的方法來研究分析單個樣本中成百上千個細胞中染色質的開放情況。通過轉座酶對混合的細胞核懸液進行核 DNA 的切割，然后使用微流控芯片將溶液中的細胞核包裹到油滴中，形成納米級的凝膠珠狀乳狀液（GEMs）。采用 10X 條形碼，對每個細胞核切割的 DNA 加上條形碼。通過文庫構建，測序，根據 10X 條形碼將測序得到的序列關聯到每個單獨的細胞核上。

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1、轉座酶切割核 DNA

細胞核懸浮液在包括轉座酶的混合液中孵育。轉座酶進入細胞核，優先在染色質的開放區域將 DNA 片段化。同時，將測序接頭序列添加到片段化的 DNA 片段的末端。

圖 轉座酶切割 DNA 示意圖

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2、GEM 生成及 Barcode 添加

在 Chromium Next GEM Chip H 芯片上，使包含有 barcode 的凝膠珠，轉座酶切割后的細胞核，混合液（包括 ATAC buffer 和 ATAC 酶），以及油滴進行混合，生成 GEMs。為了達到每個油滴中包含有單個細胞核，需要對細胞核進行有限稀釋，保證生成的大多數 GEMs(~90-99%) 不包含細胞核，而其余的為包含單個細胞核 GEMs。

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GEMs 生成后，凝膠珠會溶解釋放出含有（i) Illumina P5 序列、(ii) 16nt 10X 條形碼序列和（iii) Read 1 (Read 1N) 序列的寡核苷酸。這些核苷酸序列會于片段化的 DNA，以及混合液進行混合。后續經過熱循環后生成含有 10X barcode 的單鏈 DNA。經過孵育后，對 GEMs 進行破油處理，所有 GEMs 中的含有 10X barcode 的單鏈 DNA 混合在一起，并進行回收。

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3、破油后的純化

使用硅烷磁珠清除破油反應混合物中殘留的生化試劑。固相可逆固定（SPRI) 珠子用于從樣本中消除未使用的 10X 條形碼。

4、測序文庫的構建及質檢

通過 PCR 將 P7 接頭以及樣本的標簽（Index N）添加到文庫的兩端，形成包含有 P5 和 P7 接頭序列的文庫，用于 Illumina 橋式 PCR 擴增。

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文庫結構

圖 ?ATAC 文庫組成示意圖

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通過 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 對文庫進行質檢，結果如下：

圖 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 文庫質檢結果

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或者用 ?Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 來檢測片段大小，結果如下：

圖 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 質檢結果

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備注：

a、橫坐標表示文庫的片段程度，其中 0 代表核小體 free 的峰。1 代表包含有一個核小體的峰；2 代表包含有 2 個核小體的峰；以此類推。

b、核小體是由 DNA 和組蛋白形成的染色質基本結構單位。每個核小體由 146bp 的 DNA 纏繞組蛋白八聚體 1.75 圈形成。核小體核心顆粒之間通過 50bp 左右的連接 DNA 相連。加上兩端的 P5,P7 接頭，barcode，sample index，R1N 序列，長度大概如下：核小體 free 的峰長度 200 多 bp；1 個核小體的峰約為 300 多 bp；2 個核小體的峰約為 500bp，以此類推。

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建議測序深度及參數

指標	參數
測序深度	每個細胞核測 25000 read pairs
測序類型	PE150，dual-index（雙 index 測序）

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▲流程精簡時效快： 可檢測單細胞轉錄調控區域中的開放性染色質。

▲通量高： 每個通道 500-10000 個細胞核。

▲效率高： 細胞核捕獲率高達 65%。

▲適用范圍廣： 經驗證適用于原代細胞，凍存細胞，新鮮組織等。

▲信息分析： 獲取信息量大，可精細化分析。

▲同一份樣本可實現單細胞 ATAC、mRNA、TCR/BCR 同時測序，并整合數據。

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▲類型： 新鮮組織，原代細胞，細胞系等。

▲來源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

▲樣本量及其它質控要求：

樣本類型	樣本質控要求
細胞懸液	>1x105? 個細胞；
	活率 >80%；
	濃度 500～1,000 個細胞 /ul；
	細胞間無粘連（成團率 <5%）；
	無大于 40um 的細胞碎片或其他顆粒物；
	不存在逆轉錄抑制劑和非細胞的核酸分子。
血液	EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。
組織	0.3cm×0.3cm（不超過 0.5cm×0.5cm）的新鮮組織，4~5 塊。

▲樣本的保存與運輸：

（1）細胞懸液：建議現場制備，如要運輸，建議使用伯豪生物自主研發的單細胞保護液，4°C 運輸，48 小時內送達伯豪生物實驗室。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運輸，2 小時內送達伯豪生物實驗室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運輸。

（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發的單細胞 ATAC-seq 組織保護液，4°C 運輸，48 小時內送達伯豪生物實驗室。

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▲干細胞 / 發育生物學

▲腫瘤學

▲免疫學

▲神經科學

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1、The Cell Ranger ATAC 分析結果

10X genomics 官方的 Cell Ranger ATAC 流程會輸出一個 HTML 文件，其中包含數據統計結果和初步的分析結果。

a、基本數據統計（細胞數，每個細胞測到的數據的中位值，比對到 peaks 上的數據的比例等）

圖 ? 單細胞 ATAC 基本數據展示

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b、插入片段長度統計（包括核小體 free 的比例，單核小體的比例）

圖 插入片段長度統計（單細胞 ATAC 測序數據分析）

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c、細胞聚類結果

圖 細胞聚類結果（單細胞 ATAC 測序數據分析）

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2、Loupe Cell Browser 展示結果

Loupe Cell Browser 是一個適用于 Windows 和 MacOS 的桌面應用程序，它可以快速、輕松地可視化和分析 10X Chromium 單細胞 ATAC 數據。它在尋找顯著的峰和識別轉錄因子基序、識別細胞類型、比較各組細胞之間的染色質可及性以及探索細胞簇內的子結構方面進行了優化。

圖 Loupe Cell Browser 展示細胞分群及 peaks

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基于 RNA 的細胞注釋結果，對 ATAC 的細胞類型進行打分注釋。

圖 單細胞 ATAC 測序細胞類群注釋結果

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1、干細胞分化

造血分化是從造血干細胞分化為具有不同功能的細胞過程。造血分化過程是一個復雜、多階段的，受多種因子調控的過程，單細胞組學技術有助于解析造血干細胞轉錄和細胞命運異質性的順式和反式調節機制。2018 年，斯坦福大學的研究團隊從健康人捐贈的骨髓中分選單個細胞進行 scATAC-seq[3]，獲得了造血系統 10 個細胞類型的染色質可及性圖譜，構建了人類造血染色質可及性景觀圖來表征分化軌跡。作者利用 ChromVAR 鑒定不同細胞的 TF motif，發現了造血分化中主要的調控因子 GATA1, BATF, CEBPB 等。采用多種聚類方法對數據進行降維聚類分析，觀察到髓系共同祖細胞（commonmyeloid progenitors，CMP) 和粒細 - 巨噬細胞祖細胞（granulocyte-macrophage progenitors，GMPs) 的異質性，并繪制了各個譜系細胞分化連續軌跡。此外本研究整合了 scATAC-seq 和 ?scRNAseq 數據，將髓系分化基因的動態表達映射到染色質的動態變化，并且發現了已知的髓系分化調節因子的表達模式。將轉錄因子表達與轉錄因子 motif 對比，共發現了 14,005 個順式調控元件，這些調控元件隨著染色質開放狀態的變化也呈現顯著的異質性。總的來說，這項工作為在單細胞分辨率下對人類原代組織復雜的調節動力學進行綜合研究提供了一個框架。

圖 聯合 scATAC-seq 與 scRNA-seq 研究造血分化 [3]

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2、腫瘤異質性

乳腺癌具有高度異質性，至少可分為六種不同的固有亞型，即 luminal A、luminal B、HER2-enriched、basal-like、normal breast 和 ?claudin-low。乳腺癌起源于乳腺上皮，人類和小鼠中的乳腺上皮，由兩個主要的細胞分層構成導管上皮網絡，分別是內層管腔細胞和外層基底 / 肌上皮細胞。一系列的研究表明，在小鼠的這兩個細胞層中存在進一步的異質性。本研究應用單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）和單細胞染色質可及性測序（scATAC-seq）對分離的乳腺上皮細胞（mammary epithelial cell，MECs）進行分析 [4]，重建了小鼠 MEC 系統的細胞類型及其潛在的基因調控特征。并且在管腔細胞的分泌類型中定義了新的分化狀態，將管腔細胞分為祖細胞和成熟分泌細胞簇。通過整合 scRNA-seq 和 ATAC-seq，確定了在特定上皮細胞類型以及新定義的管腔分化狀態中差異激活的 cis 和 trans 調節元件。這項工作提供了一個重要資源來揭示與 MEC 身份和分化相關的調節元件，這將為確定乳腺癌中染色質可及性的變化提供有價值的參考。

圖 ?scATAC-seq 與 scRNA-seq 整合分析 [4]

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3、免疫學

近期美國斯坦福大學的研究團隊利用 10x Genomics 單細胞 ATAC-seq 技術，繪制了來自血液、基底細胞癌組織的 200,000 多個單細胞的染色質可及性圖譜 [5]。文章對來源于 16 個健康人外周血及骨髓細胞的 63,882 個細胞核樣本進行單細胞 ATAC 測序分析，基于染色質開放程度，鑒定出 31 個細胞亞群，并深入探索了免疫細胞譜系的調控軌跡。此外，研究團隊還對 PD- 1 治療前后采集的基底細胞癌患者的原發性腫瘤樣本進行了檢測，通過分析 37,818 個細胞的 ATAC-seq 數據，發現來源于不同患者的基質細胞、免疫細胞基本聚到一起，而腫瘤細胞的分群則表現出顯著的異質性。在 PD- 1 免疫治療后，對治療有相應的患者中出現兩種 T 細胞亞群（耗竭性 CD8+ T 細胞和 CD4+ 濾泡輔助 T 細胞）的擴張，且比例相當，暗示這兩種細胞類型在 PD- 1 阻斷后，其分化過程可能處于一致的調控模式。

圖 腫瘤細胞的的異質性及 PD- 1 治療前后細胞亞群的改變 [5]

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4、神經科學

利用單細胞 ATAC-seq 技術對成年雄性小鼠 13 個組織的單細胞染色質可及性進行了分析 [6]。結果共鑒定出 85 個亞群和 40 萬種調控元件。將單細胞染色質可及性與單細胞轉錄組比較分析，發現兩種方法注釋的細胞類型表現出高度一致性。為了研究神經元細胞中染色質可及性的異質性，對前額葉皮質細胞的數據進行分析，結果發現，興奮性神經元和中間神經元明顯地與神經膠質細胞、小膠質細胞和內皮細胞分離。并且在興奮性神經元內仍存在顯著的異質性，可能反映了前額葉皮質不同層中的表達和甲基化差異。

圖 前額葉皮質細胞中染色質可及性的異質性 [6]

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[1] Cusanovich DA, Daza R, Adey A, et al. Multiplex single cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing. Science 2015, 348(6237):910-4.

[2] Buenrostro JD, Wu B, Litzenburger UM, et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature 2015, 523(7561):486-90.

[3] Buenrostro JD, Corces MR, Lareau CA, et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell 2018, 173(6):1535-1548.

[4] Nicholas P, Quy H, Guadalupe G,?et al. Integrated single-cell transcriptomics and chromatin accessibility analysis reveals novel regulators of mammary epithelial cell identity. Biorxiv?2019 Aug 20; preprint.?biorxiv: 10.1101/740746v1.

[5] Satpathy AT, Granja JM, Yost KE, et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nat Biotechnol 2019, 37(8):925-936.

[6] Cusanovich DA, Hill AJ, Aghamirzaie D, et al. A Single-Cell Atlas of In Vivo Mammalian Chromatin Accessibility.Cell 2019, 174:1309-1324.

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序號	文件類型	查閱
1	【畫冊】單細胞全長轉錄本測序解決方案	點擊查看
2	【畫冊】石蠟樣本（FFPE）單細胞轉錄組測序解決方案	點擊查看
3	【畫冊】單細胞測序解決方案	點擊查看

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