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文章題目：Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of onvalescent patients’B cells

雜志名稱：Cell

發(fā)表單位：北京大學(xué)北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG），首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，病原與生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京微生物研究所

發(fā)表時(shí)間：2020.05.13

主要技術(shù)：10x Genomics

Pick 理由：新冠熱點(diǎn)，單細(xì)胞熱點(diǎn)，數(shù)據(jù)挖掘和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)兩種方式預(yù)測(cè)中和抗體

技術(shù)背景

新冠肺炎疫情在全球快速擴(kuò)散蔓延，目前感染人數(shù)已經(jīng)超過(guò) 750 萬(wàn)人，死亡人數(shù)超過(guò) 40 萬(wàn)。全球科研人員都在積極努力，期望找到對(duì)抗新冠病毒的有效藥物，但是目前仍沒有針對(duì)新冠肺炎的有效藥物批準(zhǔn)上市。

中和抗體是一類靶向病原體并阻斷病原體入侵細(xì)胞的特異性免疫球蛋白，由人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可以有效阻止病毒感染細(xì)胞。在新冠肺炎肆虐全球時(shí)，分離出有效的新冠抗體是一個(gè)重要的抗役措施。

研究表明，恢復(fù)期患者的血漿中含有由適應(yīng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)生的中和抗體，對(duì)輕度和重度 COVID-19 患者進(jìn)行治療，均有明顯臨床改善作用。然而血漿不能量產(chǎn)，限制了這種治療方法的廣泛使用。但是從康復(fù)病人的記憶 B 細(xì)胞中分離出中和性單抗確實(shí)一種有前景的干預(yù)治療方法，這種方法具有良好的可擴(kuò)展性和治療效果。

以病毒表面蛋白為靶點(diǎn)的人源單克隆抗體對(duì)艾滋病、埃博拉和中東呼吸綜合征等傳染病顯示出越來(lái)越多的治療和預(yù)防效果，它們對(duì)患者的安全性和效力已在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)，因此對(duì)新冠也可以嘗試這種治療方案。

6 月 5 日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)中科院微生物所抗疫科技攻關(guān)團(tuán)隊(duì)研制的新冠病毒全人源單克隆抗體的臨床試驗(yàn)申請(qǐng)，I 期臨床試驗(yàn)將在健康人體內(nèi)進(jìn)行安全和劑量測(cè)試，這也是已經(jīng)完成了非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后，在健康人群中開展的新冠肺炎治療性抗體臨床試驗(yàn)。這標(biāo)志著具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新冠病毒特異性抗體藥物成功進(jìn)入人體臨床評(píng)價(jià)階段。

主要研究成果

1. 從 60 名新冠康復(fù)患者外周血中富集出 B 細(xì)胞，通過(guò)高通量單細(xì)胞 RNA 和 VDJ 測(cè)序快速鑒定出 SARS-CoV- 2 中和抗體。

2. 鑒定出 14 種有效的中和抗體，其中 BD-368- 2 中和效應(yīng)較強(qiáng)。

3. BD-368- 2 中和抗體對(duì)感染 sars-cov- 2 的 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠也有較強(qiáng)的治療和預(yù)防作用。

4. BD-368- 2 中和抗體與 spike-ectodomain 三聚體復(fù)合物的 3.8? 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)顯示該抗體的表位與 ACE2 結(jié)合位點(diǎn)重疊。

5. 證明 SARS-CoV- 2 中和抗體可以根據(jù)其預(yù)測(cè)的 CDR3H 結(jié)構(gòu)與 SARS-CoV 中和抗體的相似性直接選擇。

在應(yīng)對(duì)大流行性傳染病時(shí)，通過(guò)高通量單 B 細(xì)胞測(cè)序可以有效地發(fā)現(xiàn)人的中和抗體。

實(shí)驗(yàn)樣本

分 6 個(gè)批次共選取 60 例新冠康復(fù)病人的 PBMC 分離出 B 細(xì)胞，分別用 CD27 抗體和 RBD 蛋白分選特定類型的 B 細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞 RNA 和單細(xì)胞 BCR 測(cè)序。CD27+ 富集細(xì)胞主要為記憶 B 細(xì)胞，生物素化 RBD 和 S 蛋白主要富集抗原結(jié)合的 B 細(xì)胞。經(jīng)過(guò)分選后每個(gè)樣本得到的 B 細(xì)胞數(shù)量并不多，因此采用多個(gè)樣本混合的方式。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理，得到 8,558 種不同的 IgG1 抗原結(jié)合克隆型。

數(shù)據(jù)總覽

分析內(nèi)容

通過(guò) scRNA 數(shù)據(jù)和 scVDJ 數(shù)據(jù)結(jié)合，將記憶 B 細(xì)胞分成了不同的亞類。圖 D 顯示了挑選克隆的標(biāo)準(zhǔn)，包括 B 細(xì)胞類型，富集頻率，可變區(qū)域突變頻率，產(chǎn)生的抗體類型等。一般認(rèn)為表達(dá) IgG1 的 B 細(xì)胞對(duì)病毒刺激反應(yīng)強(qiáng)烈，且體細(xì)胞突變（SHM）頻率高的細(xì)胞親和力更強(qiáng)。

經(jīng)過(guò)篩選后篩選出 169 個(gè)理想候選克隆，通過(guò)轉(zhuǎn)染在 HEK293 細(xì)胞中表達(dá)。同時(shí)選擇了 47 個(gè)非理想克隆作為對(duì)照。通過(guò) ELISA，表面等離子體共振等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有 rbd 結(jié)合單克隆抗體具有偽病毒中和作用，同時(shí)只有 Kd 小于或接近 ACE2/RBD 解離常數(shù)的單克隆抗體與 RBD 結(jié)合。

從豐富克隆型分離的中和單抗中，有 7 種具有較強(qiáng)的中和能力，其抗 SARS-CoV- 2 假病毒的 IC50 低于 0.05 mol / l。單克隆抗體是 BD-368-2，與 BD-368 來(lái)自同一克隆型。

為了評(píng)估它們對(duì)真實(shí)病毒的中和能力，作者使用從 COVID-19 患者中分離的真實(shí) SARS-CoV- 2 進(jìn)行了血小板減少中和試驗(yàn)（PRNT）。在所有測(cè)試的單克隆抗體中，BD-368- 2 對(duì)真實(shí)病毒的效力高，IC50 為 15 ng/mL。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 PRNT 顯示的真實(shí)的病毒中和作用，作者使用 BD-218 對(duì)真實(shí)的 SARS-CoV- 2 進(jìn)行了細(xì)胞病理效應(yīng)（CPE) 抑制試驗(yàn)。在 1.2 的濃度下，BD-218 對(duì)所有三次重復(fù)均表現(xiàn)出完全的病毒抑制作用。

為了評(píng)估鑒定出的中和單克隆抗體能否在體內(nèi)對(duì) SARS-COV- 2 起到治療干預(yù)和預(yù)防性保護(hù)作用，作者測(cè)試了 BD-368- 2 對(duì)感染 SARS-COV- 2 的 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠的中和效果。9 只 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠分成三組，小鼠實(shí)驗(yàn)采用 3 組共 9 只 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠。

1 組在病毒感染前 24 小時(shí)，將 BD-368- 2 腹腔注射進(jìn) hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，檢測(cè)其預(yù)防效果。治療組在感染后 2h 注射 BD-368-2。對(duì)照組在感染后 2 小時(shí)注射抗 H7N9 病毒 IgG1 抗體（HG1K）作為陰性對(duì)照。

感染后 5 天內(nèi)，每天記錄每只小鼠的體重，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠體重明顯下降。

作者通過(guò) qRT-PCR 分析了 5dpi 時(shí)肺部的病毒載量，發(fā)現(xiàn)在病毒攻擊前注射 BD-368- 2 可以完全抑制 SARS-CoV-2。在感染 2h 后注射可以明顯降低病毒載量。總之，小鼠實(shí)驗(yàn)證明 BD-368- 2 在體內(nèi)具有較高的治療和預(yù)防作用。

通過(guò)克隆富集篩選有親和力的抗體是一種高效的方法，然而由于取樣限制，在很多樣本中，大量克隆并未出現(xiàn)明顯富集和擴(kuò)增，可能導(dǎo)致信息的遺漏，因此使用抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)來(lái)注釋 Ig-seq 數(shù)據(jù)，可以更好地選擇單克隆抗體。研究表面通過(guò)比較與參考中和單抗 CDR3H 結(jié)構(gòu)的相似性選擇抗體是一種有效的方法。

然而對(duì)于新冠病毒來(lái)說(shuō)，目前并無(wú)可用的參考抗體。

為了解決這一問題，作者使用 3.8 ?分辨率下 BD23-Fab 與 S 胞外域三聚體復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。在這個(gè)三維重建結(jié)構(gòu)中，每個(gè) S 三聚體觀察到一個(gè)單一的 BD23-Fab，它與原聚體 B 中的“下”RBD 結(jié)合，且只有 BD-23 的重鏈可變區(qū)參與 RBD 結(jié)合。事實(shí)上，與 RBD-ACE2 復(fù)雜結(jié)構(gòu)的比較表明，BD23-Fab 與 ACE2 競(jìng)爭(zhēng)與 RBD 的結(jié)合。

這一觀察結(jié)果表明，BD-23 中和 SARS-CoV- 2 的能力來(lái)自于 ACE2-RBD 結(jié)合的破壞，這與之前鑒定的中和 SARS-CoV 的單克隆抗體高度相似。

綜上所述，SARS-CoV 和 SARS-CoV- 2 之間的結(jié)構(gòu)有高度保守性，利用 SARS-CoV 中和單克隆抗體的晶體結(jié)構(gòu)作為參考，篩選具有相似 CDR3H 結(jié)構(gòu)的 SARS-CoV- 2 抗原結(jié)合克隆型來(lái)識(shí)別中和單克隆抗體也是可行的。

鑒定出的單克隆抗體的 CDR3H 序列與 m396 (2dd8) 高度同源，通過(guò)破壞 ACE2/RBD 結(jié)合發(fā)揮中和 SARS-CoV 效應(yīng)。

令人驚喜的是，作者發(fā)現(xiàn)的 12 個(gè)單克隆抗體中有 7 個(gè)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的 RBD 結(jié)合親和力，對(duì)偽 SARS-CoV- 2 病毒具有有效中和能力。三種具有代表性的單克隆抗體 BD-503、BD-508 和 BD-515 的中和能力在真 SARS-CoV- 2 的 PRNT 中也得到驗(yàn)證，顯示出很高的中和能力。這些單克隆抗體多編碼重鏈 VH3-66/JH6 或 VH3-53/JH6 基因片段，輕鏈 VLK1- 9 或 VLK1 -33/39 基因片段。

使用雙抗體夾心 ELISA 進(jìn)行的表位封裝實(shí)驗(yàn)表明，BD-503、BD-508 和 BD-515 可能共享一個(gè)重疊的表位。還需要更多的結(jié)構(gòu)分析來(lái)獲得準(zhǔn)確的表位，以確定它們是否具有較大的保守性。

小結(jié)

近日北京新冠確診人數(shù)的增加讓人們對(duì)新冠的警惕性進(jìn)一步提升。作者鑒定的強(qiáng)中和抗體可能提供一種有效的治療和預(yù)防方案，在 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠上的結(jié)果證明了這一點(diǎn)。使用 BD-368- 2 的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。我們期待良好的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也期望本文中的方法可以擴(kuò)展應(yīng)用到其他傳染病的研究與治療中。

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