液體活檢，目前主要用于癌癥不同階段的篩查和治療。即使在無癥狀人群中，它也可以有效識別出癌癥早期患者，這一特點使之成為標準腫 瘤檢測中重要的非侵入性輔助方法。
Cell-free DNA
液體活檢中應用很廣泛的分析指標是外周血游離 DNA（cfDNA）。此外，還包括其他體液系統中腫 瘤釋放的 cfNA（cfDNA、cfRNA 等）。cfDNA 就是游離于細胞外的 DNA，它即包含 ctDNA（circulating tumor DNA）也包括來自于正常細胞的 DNA 碎片。例如，腦脊液、唾液、尿液、胸腔和腹腔積液、糞便等，都是 cfDNA 的潛在來源，上述樣本經 cfDNA 富集可用于不同類型癌癥的檢測。在健康個體中，cfDNA 來源于正常的細胞更新，而在癌癥患者中 cfDNA 含量會升高，cfDNA 長度約為 167bp，半衰期不足 1 小時。
DNA 甲基化
表觀遺傳學信息如甲基化或蛋白質生物標記物結合 ctDNA 已被證明有助于早期確定腫 瘤的起源。研究人員發現，來自甲基化組數據的腫 瘤和組織特異性模式有助于疾病分類。腫 瘤 DNA 甲基化譜與血漿 ctDNA 甲基化譜高度相關，可用于乳腺癌、結腸癌、肝癌和肺癌等疾病的診斷和預后判斷。然而，與 DNA 變異檢測類似，cfDNA 中 DNA 甲基化變化程度變化和低起始量，對檢出技術的覆蓋率、成本和靈敏度提出了挑戰。
Cell-free DNA 甲基化的臨床應用
? 癌癥篩查與早診
在無癥狀人群中，液體活檢可以用于癌癥患者的識別，以提高早期診斷和更好的干預。研究表明，腫 瘤 DNA（ctDNA）可用于早期肺癌診斷（I 期或 II 期），具有較高的敏感性和特異性。除了 DNA 突變，DNA 甲基化和 cfDNA 水平的量化可以結合起來提供穩健和一致的結果。SEPT9 基因甲基化檢測是通過美國食品與藥物管理局（FDA）批準的結腸直腸癌（CRC) 血液篩查試驗，與蛋白質標記物相比，具有更高的敏感性和特異性。我國食品和藥品監督管理局今年也首批了一款結直腸癌早篩產品，通過結合基因突變、甲基化檢測和便隱血測試，臨床結果顯示，在 4245 例結直腸癌高風險人群中，171 例陽性患者終被確診為結直腸癌，篩查靈敏度達到 91.1%。
? 微小病灶殘留和復發風險評估
微小病灶殘留（MRD) 是手術或治療后腫 瘤復發的主要原因。不幸的是，目前還沒有有效的方法來鑒別 MRD 和復發。此外，用于復發風險分層的常規臨床或病理參數不足以準確指導輔助治療，導致患者在大部分患者已治愈且不需要此類潛在有害治療的情況下，仍不得不接受不加區分的治療。已經證實，ctDNA 甲基化標記物可以提示 MRD 的存在，即使在沒有其他臨床疾病證據的情況下，也可以識別復發風險高的患者。將患者分為高風險組和低風險組將使可能受益大的患者能夠接受輔助治療，同時使低風險患者免于不必要的合并癥和不良事件的風險。近期，一項前瞻性臨床試驗評估了 II 和 III 期 CRC 患者術后 ctDNA 標志物（WIF1 和 NPY) 與腫 瘤復發的關系。采集 805 例 II-III 期 CRC 患者術前和術后的血漿樣本（NCT00958737)。在手術切除后隨訪時，采用 ddPCR 檢測 WIF1 和 NPY 在 ctDNA 甲基化情況。作者觀察到，ctDNA 陰性組 2 年無病生存率顯著高于 ctDNA 陽性組（82% vs 64%)，這表明 ctDNA 甲基化分析可以用于預測微小病灶殘留的病變。
? 治療選擇和預后
cfDNA 的半衰期較短，可以與腫 瘤細胞狀態直接相關，從而為治療期間持續動態觀察監測癌癥負擔提供了可能性。有研究表明 ctDNA 動力學與治療反應相關。例如，血清的 MGMT 的甲基化水平與原發組織高度，在 cfDNA 中檢測 MGMT 的甲基化水平能夠預測膠質細胞瘤患者在細胞毒性治療后的響應時間和進展。一項前瞻性研究驗證了乳腺癌甲基化特異性 PCR cfDNA 檢測方法，該方法針對 6 個癌癥相關啟動子的 CGI 來監測治療反應。這 6 個位點的累積甲基化得分與轉移性乳腺癌患者的生存結果顯著相關。
? ctDNA 的組織溯源追蹤
目前除了使用 ctDNA 作為液體活檢來檢測癌癥的興趣之外，它也可以用于 ctDNA 的起源和腫 瘤的定位。事實上，在每一種腫 瘤組織和每一種組織中都有獨特的 DNA 甲基化譜。因此，甲基化譜的差異可以識別 ctDNA 來源的組織。據報道，近期一項研究開發了組織特異性 DNA 甲基化生物標志物，利用基于數字 PCR 的方法測量肝臟和結腸源 DNA 的血漿濃度，并探索其在轉移性 CRC 研究中的臨床應用。結果證實了肝臟特異性標記物在反映血漿中肝臟源性 DNA 濃度方面的準確性（檢測 HCC 的特異性為 93%，敏感性為 60%)。肝源性 DNA 的絕 對 濃 度有助于有無肝轉移的 CRC 患者提供了更好的區分。這些結果表明，ctDNA 甲基化有助于腫 瘤發生的組織溯源。
Cell-free DNA 甲基化的研究方法
參考文獻：
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