標題：Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing
期刊：Cell（IF=41.582）
導讀
過去的幾十年里，癌癥免疫療法極大地改變了腫瘤治療的局面，諸如檢查點阻斷之類的療法可以顯著改善患者的臨床反應，但這些療法的效果在癌癥患者或癌癥類型之間存在極大差別。因此，確定可預測治療反應的生物標志物至關重要。
2017 年 6 月，張澤民教授及其團隊在《Cell》期刊上發表了題目為“Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing”的研究論文，該研究通過大規模單細胞測序技術對肝癌相關 T 淋巴細胞進行分析，初次在單細胞水平上描繪肝癌微環境中免疫細胞圖譜，發現了肝癌免疫療法的潛在靶點，也為我們從多角度系統性理解肝癌 T 淋巴細胞特征奠定了基礎。
科學問題
淋巴細胞在腫瘤免疫治療中起主要作用。因腫瘤浸潤淋巴細胞在不同患者及不同癌種間具有高度異質性，這些異質性導致腫瘤免疫治療效果差異顯著。突變負荷、腫瘤浸潤淋巴細胞 ?(TIL) 水平和藥物靶點表達等幾個因素與患者對抗 CTLA4 或抗 PD1 療法的反應有一定的相關性，但這些通常不夠穩健，無法統一用作臨床生物標志物。因此，確定可預測治療反應的生物標志物至關重要，而新型癌癥免疫療法的開發和有效生物標志物的鑒定需要對腫瘤駐留 T 細胞的深入了解。
實驗設計
實驗分組
對照組：來自 6 例肝癌患者的外周血，肝癌組織的 T 細胞
實驗組：來自相同 6 位肝癌患者的癌旁正常組織的 T 細胞
實驗關鍵技術
單細胞 RNAseq，流式細胞術
實驗結果
1、肝癌相關 T 淋巴細胞亞型分析
為揭示肝癌相關 T 淋巴細胞內在特性及其潛在的功能亞型，作者對來自 6 位肝癌患者外周血、鄰近正常組織和腫瘤組織的 CD8+? 細胞毒性 T 細胞（PTC、NTC 和 TTC）和對應位置的 CD4+ CD25- T 細胞（PTH、NTH 和 TTH）及 CD4+ CD25high T 細胞（PTR、NTR 和 TTR）進行單細胞轉錄組測序。對測序結果降維聚類，共聚類為 11 個 T 細胞亞群：5 個 CD8+ T 細胞亞群和 6 個 CD4+ T 細胞亞群，每個亞群都有其獨特表達的特征基因。其中 C1_CD8-LEF1，主要是來源于外周血，特異性表達 na?ve T 細胞標記基因；C2_CD8-CX3CR1，高表達 T 細胞效應功能相關基因；C3_CD8-SLC4A10, MAIT（Mucosal-Associated Invariant T cells）細胞；C4_CD8-LAYN，主要來源于腫瘤組織，高表達耗竭性標記基因；C5_CD8-GZMK，與 C4 存在一些共同表達的基因，但特異表達 GZMK 基因。其中 C1_CD8-LEF1 T 細胞亞群和 C2_CD8-CX3CR1 細胞亞群主要存在于外周血中，MAIT 細胞主要分布在腫瘤相鄰的正常肝組織中，而在腫瘤組織中主要為耗竭性 CD8+ T 細胞。
CD4+ T 細胞分為 6 個亞群：C6_CD4-CCR7 亞群主要來源于外周血，特異表達初始 T 細胞標記基因，C7_CD4-FOXP3 主要是外周血分離的 Tregs 細胞，C8_CD4-CTLA4 是一群在腫瘤組織中高度富集的 Tregs 細胞，C9_CD8-GZMK，主要是來源正常組織和腫瘤組織中的 Th 細胞，C10_CD4-CXCL13 是一群耗竭性 CD4 T 細胞。C11_CD4-GNLY 是一群具有細胞毒性的 CD4 T 細胞。
圖 1. T 細胞亞型分析
2、HCC 浸潤性 Tregs 和耗竭性 CD8+?T 細胞特有相關基因的確定
由于 HCC 浸潤性 Tregs 細胞亞群（C8_CD4-CTLA4）和耗竭性 CD8 T 細胞亞群表達的共抑制受體（如 PDCD1 和 TIGIT）是癌癥免疫療法的重要靶標，因此作者選擇這兩個 T 細胞亞群做進一步的分析。在腫瘤侵潤性 Tregs 中共鑒定出 401 個特異表達基因，如 FOXP3、CTLA4、TNFRSF18、TNFRSF4 和 CCR8 等；在腫瘤耗竭性 CD8 T 細胞中，獲得了 82 個特異性耗竭標記基因，其中除了已報道過的耗竭標記基因，還發現了新的耗竭相關基因，如 LAYN，PHLDA1 和 SNAP47 等。其中 22 個耗竭標記基因（如 CTLA4 和 LAYN）也在腫瘤侵潤性 Tregs 細胞中高表達。
上述結果中，作者發現 LAYN 基因在腫瘤侵潤 Tregs 和耗竭性 CD8+ T 細胞中特異性表達，且 LAYN 的高表達與低生存率有關。因 LAYN 是一種細胞表面蛋白，作者通過流式細胞術發現，靜息期的 CD14+ 髓細胞、B 細胞、CD4+ T 細胞、Tregs 或 CD8+ T 細胞中并不表達 LAYN，但用抗 CD3 和抗 CD28 抗體激活 T 細胞 2 天后，超 30% 的 Tregs 細胞和 CD8+ T 細胞中檢測到了 LAYN 的表達。已知 FOXP3 是 Treg 細胞分化和功能相關的關鍵轉錄因子，而轉錄因子 Helios 能夠穩定 FOXP3 的表達，抑制 Tregs 細胞功能。因此，作者進一步分析了 FOXP3+ Helios+ Tregs 細胞中 LAYN 的表達。結果顯示，在 FOXP3+ Helios+ Tregs 細胞中，LAYN 被優先上調，表明 LAYN 可能與 Tregs 細胞抑制性和穩定性有關。而在 CD8 T 細胞中過表達 LAYN 后，IFN- γ 明顯減少，說明 LAYN 的表達與 T 細胞抑制性有關，也進一步證實了腫瘤微環境中的 T 細胞更易于向耗竭態轉變或存在 Treg 抑制，從而阻止 CD8 T 細胞對腫瘤細胞殺傷作用。
圖 2. HCC 浸潤 Treg 細胞和耗竭 CD8+ T 細胞基因表達特性
3、TCR 分析及擬時序分析子集映射
已知由同一細胞分化而來的 T 細胞具有相同的 TCRs, 作者分析每個樣本的 TCR 數據發現，雖然大多數細胞含有獨特的 TCR，但在不同細胞類型中觀察到不同程度的重復使用模式，尤其在腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞和 Treg 中，表明兩種細胞存在共同的祖先細胞起源。且腫瘤組織 CD8+ T 細胞和 Treg 細胞中 TCR 克隆的數量顯著高于血液和鄰近正常組織中的數量，這很可能是腫瘤環境中局部 T 細胞增殖和激活的結果。
擬時序分析構建 CD8+ T 細胞和 CD4+ T 的發育軌跡。CD8+ T 細胞擬時序結果顯示，每個簇中的大多數細胞基于表達相似性聚集，不同的簇在偽時間中形成連續分化過程，從 C1_CD8-LEF1 細胞（幼稚 CD8+ T 細胞）開始，然后是 C2_CD8-CX3CR1（效應記憶 CD8+ T 細胞）、C5_CD8-GZMK，并以 C4_CD8-LAYN 細胞（耗竭 CD8+ T 細胞）結束。耗竭 T 細胞在偽時間后期高度富集，表明 T 細胞狀態從激活過渡到耗竭。CD4+ T 細胞擬時序分析結果顯示，C6_CD4-CCR7 幼稚 T 細胞和 C9_CD4-GZMA T 輔助細胞主要聚集在偽時間主干上，C10_CD4-CXCL13（耗竭 CD4+ T 細胞）和 C11_CD4-GNLY（細胞毒性 CD4+ T 細胞）細胞位于偽時間軌跡圖中的不同方向，表明這些細胞在功能上存在差異。
圖 3. 肝癌 T 細胞克隆分析及擬時序分析
4、HCC 微環境中耗竭性 CD8+?T 細胞和 Treg 細胞克隆富集
隨后作者重點分析了 HCC 腫瘤浸潤 T 細胞，發現腫瘤微環境中的效應 CD8+ T 細胞顯著減少，而耗竭表型顯著上升。此外，有少量耗竭 CD8+ T 細胞表達 Treg 標記物 FOXP3，這些細胞還表達細胞溶解相關基因，表明這群細胞存在抑制性和細胞殺傷特性。HCC 微環境促進浸潤的 CD8+ T 細胞轉變為衰竭狀態，從而抑制 CD8+ T 細胞對腫瘤細胞殺傷作用。
參考文獻：
1. Zheng C, Zheng L, Yoo J-K, et al (2017) Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 169:1342-1356.e16. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.035.
