2020 年 11 月 26 日，Kiel University 在 Immunity（IF：21.5）上在線發表了一項研究，利用 14 名患者的多個外周血樣本分析了 bulk 轉錄組、bulk DNA 甲基化組和單細胞轉錄組。結果顯示重度 COVID-19 患者的特點是增殖、代謝增強的漿母細胞增加，同時研究人員還發現 IFN 激活的循環巨核細胞擴張，紅系生成增加，且具有缺氧信號的特征。巨核細胞和紅細胞衍生的共表達模式可能對疾病結果具有一定的預示功能。該研究表明 SARS-CoV- 2 感染影響了多種細胞的廣譜免疫功能。

1、實驗設計

14 個住院的 COVID-19 患者的 5 個外周血樣本，作者采用了 scRNA-seq（10x Genomics），單細胞 B 細胞受體（BCR），RNA-seq、DNA 甲基化分析和多重細胞因子 ELISA 分析（圖 1A）。作者使用了經過修改的 WHO 序數量表，該量表還考慮了幾種炎癥標志物（血清 C 反應蛋白 [CRP]，血清 IL- 6 和鐵蛋白），該分數用于對患者的病程進行分類（圖 1B 和 1C）。

圖 1 用于疾病軌跡分析的疾病階段的臨床定義

2、scRNA-seq 分析確定細胞分化軌跡

scRNA-seq 共得到 358,930 個細胞的數據，每個樣品平均有 10,900 個細胞；注釋得到 37 個不同的細胞亞群；聚類結果顯示單核細胞亞群中個體間的異質性較高；跨時間點的計數揭示了幾種細胞類型的變化，包括單核細胞，增生性淋巴細胞和自然殺傷（NK）細胞，經典 CD14 + 單核細胞的增加，尤其是在恢復期，而非經典 CD16 + 單核細胞的數量在擬時序 2 和 3 都增加了，研究發現 COVID-19 患者外周血中幾種源自骨髓的前體細胞類型的存在增加，并且在整個疾病過程中，巨核細胞（MK）比例明顯升高。

圖 2 沿擬時序結果 UMAP 展示

3、 全血轉錄組特征沿 COVID-19 疾病軌跡動態變化

接下來分析了 13 個住院患者的全血轉錄組學數據，從較多 5 個時間點開始與恢復對照進行比較，并將特征與 14 個健康對照進行比較。在健康對照和 COVID-19 患者之間，在對照與每種疾病軌跡假時的成對比較中，共有 5,915 個基因差異表達。與健康對照組相比，COVID-19 患者中大多數差異表達基因（DEG）的表達水平更高。早期變化包括免疫球蛋白轉錄本（IGHA1 和 IGHG1）和乳鐵蛋白（LTF）的增加，而編碼 Th17 特異性轉錄因子（TF）和 II 類 HLA 轉錄本的 RORC mRNA 水平在整個病程中均下降。IL-1β 和血管舒張信號轉導相關的基因在增量軌跡中（擬時序 1）高表達。從逐漸恢復到晚期恢復期（擬時序 1、3 和 4），編碼核糖體結構蛋白的轉錄物大量減少，這可能反映了 I 型干擾素對蛋白合成裝置的普遍抑制。相反，在疾病活動高峰期，與 IFN 相關的轉錄產物顯著增加，但是在關鍵疾病類別中卻受到抑制。通過構建代謝模型，發現與康復和健康個體相比，炎性疾病狀態與更高數量的預測代謝活性途徑相關。

圖 3  COVID-19 中全血基因表達的動力學

4、縱向共表達模塊可確定關鍵疾病中干擾素應答的受損 以及血栓和紅細胞生成增加的特征

作者使用從成對和縱向分析（6,317 個基因）的組合中識別出的所有 DEG 進行加權基因共表達網絡分析。分析確定了共 10 個共表達基因的模塊，M1-M10，它們在整個 COVID-19 疾病階段遵循不同的表達方式。評估模塊與 scRNA-seq 結果的細胞類型和臨床參數之間的個體相關性 C。在 scRNA-seq 數據上預測每個模塊的 hub 基因的表達，揭示了細胞類型和擬時序特異性表達模式。基因集富集分析揭示了每個模塊中富集的生物學過程和途徑。

圖 4 差異表達基因的共表達分析和甲基化變化的整合

5、全血 DNA 甲基化分析揭示了與基因表達相關的 COVID-19 中的全基因組低甲基化

與健康對照進行成對比較，在擬時序之間鑒定出 46,071 和 69,733 個差異甲基化的 CpG 位點，與健康對照相比，每個時間點都存在大量的低甲基化位點。細胞反卷積分析鑒定出與 COVID-19 相關的 DNAm 基因的主要部分來自粒細胞，B 細胞，NK 細胞和單核細胞。

圖 5  COVID-19 的全基因組 DNA 甲基化

6、 整個 COVID-19 疾病軌跡的成漿細胞和 B 細胞變化

將 scRNA-seq 數據中 22190 個 B 細胞提取出來，將 B 細胞細分，其中包括 11509 個記憶 B 細胞，3993 個 na?ve B 細胞，383 個過渡性 B 細胞和 6,295 PB 細胞。在 COVID-19 期間，PB 在很大程度上處于擴張狀態，在高炎癥期處于高水平；富集分析發現 PB 中代謝通路顯著富集。來自炎癥狀態的 PB 表現出較高的代謝活性，僅在恢復時才降低，而記憶和 na?ve B 細胞在疾病狀態之間的總體代謝活性上沒有顯示出顯著差異。PB 中增加的代謝過程是氧化磷酸化，乙醛酸和二羧酸酯代謝，NAD 合成以及各種氨基酸代謝途徑（包括甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸）的增加。預計糖酵解在炎癥疾病階段具有低活性狀態，而在臨床恢復中則具有很高的活性（擬時序 6）。該分析確定了 PBs 的廣泛活化，并暗示了細胞向氨基酸代謝的強烈的免疫代謝轉變，這可能有助于重癥 COVID-19 中所見的免疫病理學。

圖 6 B 細胞亞群細分

7、 巨核細胞數量升高是 COVID-19 的全身炎癥反應的特征

將 5,870 個巨核細胞分成兩個亞群，HSC 和 MEP，與健康對照組相比，恢復期的 HSC 和 MEP 顯著增加，在危重患者中觀察到偽編碼丙酮酸激酶的 PKM 轉錄量（PKM2）大量增加，并與 HIF1A 相互作用并促進其活性（擬時序 2）。在這一組中，還存在高表達的 FCER1G，它編碼負責整合素（ITGA2-GP6）介導的血小板粘附的常見 FcRγ 鏈銜接子。盡管與健康對照組比較其水平低于 PBs，但是代謝建模確定了 MKs 沿疾病軌跡增加的代謝活性。預測過程與能量代謝（丙酮酸代謝，糖酵解和活性氧 [ROS] 解毒）顯著相關。

圖 7 巨核細胞水平升高是 COVID-19 的特征

文章提到細胞類型的 marker