【文章題目】Opposing Wnt signals regulate cervical squamocolumnar homeostasis andemergence of metaplasia

【雜志名稱】Nature Cell Biology(IF=17.73)

【發(fā)表時(shí)間】2021 年 1 月 18 日

【主要技術(shù)】10XGenomics

主要結(jié)果

鱗狀上皮和柱狀上皮細(xì)胞來源不同

宮頸連接宮腔和陰道，由宮頸外和宮頸內(nèi)兩部分組成。宮頸內(nèi)壁的柱狀上皮與子宮腔相鄰，由內(nèi)口隔開，而宮頸外的鱗狀上皮伸向陰道。外口標(biāo)志著從宮頸外到宮頸內(nèi)的過渡，在那里柱狀上皮與鱗狀上皮相遇，形成鱗狀柱狀上皮交界處（SCJ)(圖 1)。

▲圖 1   小鼠（Mm）和人（Hs）女性生殖道（FGT）的示意圖

作者對健康小鼠的宮頸內(nèi)膜、宮頸外和過渡區(qū)這 3 個(gè)組織區(qū)域進(jìn)行 ScRNA-seq 和聚類分析，根據(jù)細(xì)胞特異性的 marker 基因?qū)喨悍殖?7 種類型：基質(zhì)細(xì)胞（Stromal)，平滑肌細(xì)胞（SMC)，周細(xì)胞（Pericytes)，神經(jīng)細(xì)胞（Neural)，免疫細(xì)胞（Immune)，上皮細(xì)胞（Epithelial)，內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelia)(圖 2b,c)。

聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸內(nèi)的細(xì)胞類型與過渡區(qū)的細(xì)胞類型相似，但宮頸外的上皮細(xì)胞（Epithelial)、基質(zhì)細(xì)胞（Stromal)、免疫細(xì)胞（Immune) 和平滑肌細(xì)胞（SMC) 亞群顯示出不同的轉(zhuǎn)錄譜（圖 2a）。

▲圖 2   健康小鼠的宮頸內(nèi)膜、宮頸外和過渡區(qū)組織的 scRNA-seq 結(jié)果  

對上皮細(xì)胞群體進(jìn)行重新聚類，揭示了兩種主要的上皮細(xì)胞類型：Krt5hi/Krt14hi 鱗狀細(xì)胞（SQ) 和 Krt8hi/Krt19hi 柱狀細(xì)胞（Co)。這些進(jìn)一步被分為六個(gè)轉(zhuǎn)錄上不同的亞群（SQ1、Sq2A、Sq2B、SQ3、CO1 和 CO2)，其中將肌上皮細(xì)胞（Me) 歸類為 Krt5hi/Krt14hi 亞群，它與 KRT5+ 細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞有相同的基因表達(dá)譜。同時(shí)也表達(dá)成纖維細(xì)胞 marker 即 Col6a2。這些細(xì)胞可能是鱗狀細(xì)胞系的候選前體（圖 3)。

▲圖 3   健康小鼠的宮頸內(nèi)膜、宮頸外和過渡區(qū)組織上皮細(xì)胞細(xì)分結(jié)果

SQ1 亞群含絲分裂相關(guān)基因，表達(dá) Trp63、Birc5、Mki67、Cks2 和 Hmgb2，表明復(fù)層宮頸的基底干細(xì)胞。Sq2A 和 Sq2B 亞群含皮膚發(fā)育和應(yīng)激或損傷反應(yīng)基因，并表達(dá) Trp63、Krt15、Dkk3 和 Notch1。SQ3 亞群含角質(zhì)形成細(xì)胞分化和皮膚發(fā)育基因，表達(dá) Fam25c、Gm94、Krt6a 和 Krt10，表明鱗狀細(xì)胞分化。

CO1 亞群含分支上皮形態(tài)發(fā)生和脂質(zhì)分解過程相關(guān)基因，表達(dá) Anpep、Cxcl17、Krt8 和 Krt18。CO2 亞群含應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和對未折疊蛋白的反應(yīng)基因，并表達(dá) Krt19、Ltf、Muc1 和 Psca(圖 3)。

▲圖 3   上皮細(xì)胞亞群的相關(guān) GO 富集結(jié)果

熒光免疫組織化學(xué)和 smRNA-ISH 證實(shí) KRT5 和 KRT8 分別標(biāo)記了整個(gè)鱗狀分層和柱狀上皮細(xì)胞。作者通過 Krt5-CreERT2；Rosa26-tdTomato 和 Krt8-CreERT2；Rosa26-tdTomato 小鼠進(jìn)行譜系追蹤，Krt5+ 細(xì)胞僅標(biāo)記復(fù)層上皮，而 Krt8+ 細(xì)胞僅標(biāo)記宮頸內(nèi)上皮。兩種上皮在過渡區(qū)融合，而 Krt5+ 鱗狀細(xì)胞似乎取代了覆蓋 Krt8+ 的柱狀細(xì)胞。結(jié)果表明這兩種上皮細(xì)胞類型來自兩個(gè)不同的譜系（圖 4）。

▲圖 4   宮頸的鱗狀和柱狀譜系以及過渡區(qū)的示意圖

過渡區(qū)的上皮邊界由不同的基質(zhì) Wnt 信號界定

作者通過類器官模型來確認(rèn)維持這兩種上皮細(xì)胞的干細(xì)胞微環(huán)境是不同的。在 Wnt- 的培養(yǎng)基（不含 Wnt3a 和 Rspo1) 中培養(yǎng)的宮頸內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生 P63+，Krt5+ 復(fù)層的類器官，類似于宮頸外類器官。源自宮頸外的細(xì)胞僅產(chǎn)生鱗狀類器官，說明與 Wnt 無關(guān)。而柱狀類器官的形成是依賴于 Wnt 的，與鱗狀類器官的形成不同。類器官的 Microarray 分析表明，Wnt 在宮頸內(nèi)細(xì)胞和宮頸外細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有所不同：Wnt 激動(dòng)劑在柱狀上皮中上調(diào)，而 Wnt 拮抗劑 Dkk1 和 KREMEN1 在鱗狀上皮中上調(diào)（圖 5)。

▲圖 5   人宮頸外與宮頸內(nèi)類器官差異調(diào)控基因的表達(dá)分析

為了深入了解基質(zhì)如何影響這兩種不同的宮頸上皮的動(dòng)態(tài)平衡，作者結(jié)合 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的聚類分析揭示了基質(zhì)細(xì)胞群的五個(gè)轉(zhuǎn)錄上不同的亞群。S1，S2 和 S3 亞群代表宮頸內(nèi)膜移行區(qū)的細(xì)胞，通常表達(dá) Hes1，Nfkbia 和 Egr1。S2 亞群高表達(dá) Wnt16 和 Axin2，S3 亞群高表達(dá) Mmp3，Adh1，Ces1d，Cxcl16，Rspo1 和 Rspo3。亞群 S4A 和 S4B 代表宮頸基質(zhì)細(xì)胞；亞群 S4A 顯示 Sfrp1 和 Bmp4 的優(yōu)先表達(dá)，亞群 S4B 表達(dá) Dkk2 和 Crabp1。smRNA-ISH 分析也證實(shí)了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)（圖 6)。

▲圖 6   健康小鼠的宮頸內(nèi)膜、宮頸外和過渡區(qū)組織基質(zhì)細(xì)胞的重新聚類結(jié)果

為了進(jìn)一步研究 DKK2 和 DKK3 的作用，作者將宮頸內(nèi)膜類器官重新接種在含有 WNT3A 和 RSPO1 加 DKK2/DKK3/DKK2 和 DKK3 的培養(yǎng)基中。將 Wnt 缺乏的培養(yǎng)基用作對照。DKK2 的存在導(dǎo)致柱狀類器官大小的顯著減少，類似于在 Wnt 缺乏的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的那樣，這證實(shí) DKK2 發(fā)揮了抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中還含有 DKK3 時(shí)，可以避免這種情況。DKK3 要么對 Wnt 信號沒有影響，要么作為 Wnt 激動(dòng)劑發(fā)揮作用。用 Wnt 抑制劑 2(IWP2) 阻斷 Wnt 信號，抑制宮頸內(nèi)類器官生長，但不影響宮頸外類器官。這表明鱗狀上皮不依賴于細(xì)胞自主的 Wnt 信號。

▲圖 7   人宮頸內(nèi)膜柱狀類器官和宮頸外復(fù)層類器官大小

用 DKK2 或 IWP2 處理后，柱狀和鱗狀類器官中譜系特異性標(biāo)記 KRT5，KRT8 和 p63 的表達(dá)沒有差異。總之，這些數(shù)據(jù)表明宮頸的上皮由兩個(gè)不同的干細(xì)胞群體維持，它們的命運(yùn)由相反的 Wnt 信號微環(huán)境決定，在過渡區(qū)具有明確的開關(guān)（圖 8）。

▲圖 8   過渡區(qū)不同上皮譜系和組織微環(huán)境的示意圖

WNT 拮抗劑、Notch 和 EGFR 信號通路維持宮頸外干性和分化

基因芯片分析顯示，Notch 相關(guān)基因在宮頸外鱗狀類器官中的表達(dá)高于在宮頸內(nèi)柱狀類器官中的表達(dá)（圖 9)。

▲圖 9   人宮頸外和宮頸內(nèi)類器官差異基因熱圖

作者通過對 2D 生長的宮頸外胚層細(xì)胞（2D-ECTO)、三天大的早期類器官（EO-ECTO) 和兩周大的成熟類器官（DO-ECTO) 進(jìn)行比較分析來確認(rèn)分化的機(jī)制。結(jié)果表明 2D-ECTO 和 EO-ECTO 的基因表達(dá)譜具有很高的相似性，但與 DO-ECTO 相比有著明顯差異（圖 10e)。同樣的，2D-ECTO 和 EO-ECTO 與干細(xì)胞 marker 的基因集中的表達(dá)譜有很高的相似性，但成熟的 DO-ECTO 則不同（圖 10f)，這說明 2D-ECTO 和 EO-ECTO 的細(xì)胞對應(yīng)于宮頸外干細(xì)胞。對宮頸外干細(xì)胞相對于分化細(xì)胞上調(diào)的基因的調(diào)查顯示，Notch 配體 DLL3 和 MFNG 高表達(dá)。而分化的細(xì)胞高表達(dá) NOTCH2 和 NOTCH3 受體及其靶點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)錄因子 HES1 和 γ 分泌酶的核心成分 PSEN1。宮頸外干細(xì)胞也表達(dá) Dkk1 及其受體 KREMEN2(圖 10g)。因此，使用 γ - 分泌酶抑制劑 DBZ 阻斷 Notch 激活會抑制類器官的生長，無法分化和分層。由此表明宮頸干細(xì)胞充當(dāng) Notch 信號的來源，而分化細(xì)胞充當(dāng) Notch 信號的接收細(xì)胞，其是促進(jìn)分化和上皮分層的反式激活相互作用。

▲圖 10  2D-ECTO、EO-ECTO、DO-ECTO 差異基因熱圖

GSEA 富集顯示，受 Notch 下游轉(zhuǎn)錄因子和 EGFR-Ras-MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的基因在宮頸外干細(xì)胞中高度富集，包括轉(zhuǎn)錄因子 AP1、CREB、ETS、NERF、ELK1、E2F、SRF、MYC 和 YY134-37(圖 11)。這兩條途徑共同調(diào)節(jié)增殖和分化，與表皮生長因子在層狀類器官形成中的重要作用一致。相反，屬于 RAS 拮抗的 NF1 通路的基因在分化細(xì)胞中富集。這些發(fā)現(xiàn)表明，Wnt 拮抗劑與 EGFR 和 Notch 誘導(dǎo)通路共同調(diào)節(jié)宮頸外干性和分化。

▲圖 10 GSEA 富集共有轉(zhuǎn)錄因子的順式調(diào)控 motifs 相關(guān)基因熱圖

基質(zhì)區(qū)室的重塑導(dǎo)致 Krt5+ 鱗狀化生的出現(xiàn)

為了研究與宮頸外鱗狀上皮的干性和分化有關(guān)的信號通路和細(xì)胞類型在鱗狀化生中的作用。作者將人子宮內(nèi)膜來源的柱狀細(xì)胞放在 Wnt+ 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，會產(chǎn)生少量的 Krt5+ 或 p63+ 細(xì)胞，同樣培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到類器官條件下會產(chǎn)生柱狀類器官；然而在 Wnt- 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，出現(xiàn)對 Krt5+ 和 p63+ 細(xì)胞的顯著富集的情況，在轉(zhuǎn)移到類器官條件下，即使在 Wnt3a 和（或）Rspo1 存在的情況下，這些細(xì)胞也只產(chǎn)生鱗狀類器官。相比之下，之初 Wnt+ 或 Wnt- 的培養(yǎng)基中生長的人宮頸外細(xì)胞，在轉(zhuǎn)移到 Wnt- 的培養(yǎng)基后只產(chǎn)生鱗狀類器官。這表明子宮內(nèi)膜中存在鱗狀干細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境下可以產(chǎn)生 Krt5+p63+ 細(xì)胞。

作者通過誘導(dǎo) Krt5-CreERT2；Rosa26-tdTomato 和 Krt8-CreERT2；Rosa26-tdTomato 小鼠的譜系追蹤證實(shí)了柱狀上皮和復(fù)層宮頸上皮來自兩個(gè)不同的譜系，每一個(gè)譜系都對特定的微環(huán)境做出反應(yīng)。改變 Wnt 信號不會誘導(dǎo)柱狀細(xì)胞向?qū)訝罴?xì)胞的轉(zhuǎn)分化，反之亦然。

為了分析體內(nèi)的化生發(fā)展，研究人員利用了缺乏維生素 A 的飲食喂養(yǎng)的小鼠的模型，在該模型中，鱗狀化生的異常病灶出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜。為了確定上皮和基質(zhì)的變化，他們對從宮頸內(nèi)、宮頸外、過渡區(qū)和宮頸內(nèi)化生（即化生灶）分離的細(xì)胞進(jìn)行了 scRNA-seq 和聚類分析（圖 11）。

圖 11  健康小鼠宮頸外，宮頸內(nèi)，過渡區(qū)和 VA 缺乏引起的鱗狀化生的 scRNA-seq

上皮群體被細(xì)分成 Sq，Co 和 Me 亞群，根據(jù)每個(gè)上皮亞群的表達(dá)譜生成的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：鱗狀細(xì)胞亞群（SQ1、Sq2A、Sq2B 和 SQ3) 和 Me 細(xì)胞（Me) 在轉(zhuǎn)錄上相似，但與柱狀亞群（CO1 和 CO2) 不同。Sankey 圖是用來分析每個(gè)組織區(qū)域的上皮細(xì)胞對不同亞群的轉(zhuǎn)錄貢獻(xiàn)，結(jié)果表明與健康的宮頸內(nèi)膜上皮相比，宮頸內(nèi)膜化生表現(xiàn)出與鱗狀上皮和肌上皮型相似的表達(dá)譜的擴(kuò)增（圖 12)。

▲圖 12  上皮亞群的表達(dá)譜生成的系統(tǒng)發(fā)育樹和 Sankey 圖

作者通過對宮頸內(nèi)、宮頸外、移行區(qū)和宮頸內(nèi)化生的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行重新聚類來描述基質(zhì)細(xì)胞亞群的變化（圖 13a)。宮頸上皮內(nèi)化生的基質(zhì)部分與健康的宮頸內(nèi)、宮頸外和移行區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞有明顯的差異（圖 13b)。，Sankey 圖同樣表明了宮頸內(nèi)化生（S2B、S2C 和 S2D) 中出現(xiàn)了與健康宮頸以及外宮頸不同的基質(zhì)細(xì)胞亞群（圖 13c)。作者還觀察到 Dkk2 在宮頸內(nèi)化生的一個(gè)亞群中表達(dá)增加，這主要對應(yīng)于健康小鼠的宮頸外 S4B。這些數(shù)據(jù)表明，在化生發(fā)育過程中，基質(zhì)發(fā)生了廣泛的改建（圖 13e）。

▲圖 13  健康小鼠宮頸外，宮頸內(nèi)，過渡區(qū)和 VA 缺乏引起的鱗狀化生基質(zhì)細(xì)胞 t -SNE 和 Sankey 圖

宮頸癌 SCC 和 ADC 的基因表達(dá)模式與鱗狀和柱狀器官特征相關(guān)

成體干細(xì)胞易轉(zhuǎn)化，通常構(gòu)成各種癌癥的起源細(xì)胞。到目前為止，尚不清楚 ADC 和 SCC 起源于哪種細(xì)胞類型。作者根據(jù)鱗狀和柱狀宮頸類器官的基因表達(dá)特征來確定宮頸癌起源的可能細(xì)胞。TCGA 中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)將宮頸癌分為 ADC 和高角蛋白 SCC 組和低角蛋白 SCC 組，其中低角蛋白 SCC 組顯示鱗狀上皮特異性標(biāo)記物的較低表達(dá)。作者根據(jù)宮頸外鱗狀上皮和宮頸內(nèi)柱狀上皮之間差異表達(dá)的基因，將癌癥樣本分為鱗狀上皮樣和柱狀上皮樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分類為柱狀樣或鱗狀樣的癌癥與分類為 ADC 或 SCC 的組織學(xué)分類之間存在一致性；這從與 ADC 或角蛋白高和角蛋白低組的 TCGA 簇的比較中也是明顯的。

其中一組腫瘤含量低，與宮頸外或?qū)m頸內(nèi)征象無明顯相似性的病例被分類為未確定病例。然而，在 62 例未確定的病例中，有 59 例落在 TCGA 定義的角蛋白低或高角蛋白的鱗狀細(xì)胞癌叢中。值得注意的是被歸類為柱狀的癌癥樣本主要是 KRT5low、KRT7high 和 TP63low，而被歸類為鱗狀和未確定的癌癥樣本主要是 KRT5high 和 TP63high，并混有的 KRT7。這表明未確定的組可能由宮頸內(nèi)或從宮頸內(nèi)長出的 SCC 組成，導(dǎo)致樣本中存在污染的 KRT7+ 宮頸柱狀細(xì)胞。

研究表明位于過渡區(qū)的 SCJ 細(xì)胞表達(dá) KRT7、CD63、GDA、AGR2 和 MMP7，這些細(xì)胞是 SCC 和 ADC19 的前體細(xì)胞。因此作者研究了類器官和 TCGA 宮頸癌樣本中的基因表達(dá)水平，檢測了 SCJ 標(biāo)記物 Krt5。這些標(biāo)記物在宮頸內(nèi)類器官和 ADC 中的表達(dá)明顯高于在宮頸外類器官和鱗癌中的表達(dá)，而 Krt5 的表達(dá)趨勢則相反。人和小鼠宮頸組織切片的免疫組織化學(xué)和 smRNA-ISH 證實(shí) Krt5 在整個(gè)鱗狀上皮中均有表達(dá)。KRT7 在整個(gè)柱狀上皮中表達(dá)，在較小程度上在鱗狀上皮中表達(dá)，而不是僅限于過渡區(qū)。宮頸外類器官對鱗狀上皮標(biāo)記 Krt5 和 CTSA 呈陽性反應(yīng)，而宮頸內(nèi)類器官對柱狀上皮標(biāo)記 KRT7、AGR2、GDA 和 Kr18 呈陽性反應(yīng)。這意味著已報(bào)道的 SCJ 細(xì)胞與宮頸柱狀細(xì)胞譜系沒有區(qū)別，也不是 SCC 的起源細(xì)胞。

與角蛋白高和角蛋白低的鱗狀細(xì)胞癌均起源于鱗狀細(xì)胞系的觀點(diǎn)一致，該研究還揭示了高角蛋白和低角蛋白的鱗狀細(xì)胞癌和 ADC 組之間的差異表達(dá)基因。作者在柱狀癌和鱗狀癌（包括 MUC5B、KRT5 和 CSTA) 中觀察到雙模式基因表達(dá)，它們將 ADC 與 SCC 區(qū)分開來。SCJ 的標(biāo)記物 KRT7、AGR2 和 GDA 只標(biāo)記 ADC，而不標(biāo)記 SCC。綜上所述，大多數(shù)宮頸癌可以根據(jù)分子特征分為兩組：SCC 可能起源于宮頸外的 Krt5+ 鱗狀譜系，而 ADC 可能起源于宮頸內(nèi)的 KRT7+KRT8+ 柱狀譜系（圖 14）。

▲圖 14  宮頸癌 SCC 和 ADC 的轉(zhuǎn)錄特征與鱗狀和柱狀上皮譜系相關(guān)

總結(jié)

綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明宮頸鱗狀上皮和柱狀上皮起源于兩種不同的譜系特異性干細(xì)胞類型，并確定了這些譜系的亞群。此外，宮頸內(nèi)外有不同的基質(zhì)亞群，構(gòu)成了維持過渡區(qū)的微環(huán)境梯度。通過信號梯度調(diào)節(jié)干細(xì)胞的維持、分化和組織構(gòu)型是發(fā)育過程中的普遍原則，其中 Wnt 信號是不可或缺的。在基質(zhì)中存在 Wnt 梯度，它選擇性地驅(qū)動(dòng)柱狀譜系，同時(shí)對同一組織中存在的鱗狀譜系特異性干細(xì)胞施加靜止。在鱗狀化生中，宮頸內(nèi)基質(zhì)經(jīng)歷了廣泛的改建。作者還觀察到 Wnt 抑制劑 DKK2 在基質(zhì)亞群中上調(diào)。這種向 Wnt 抑制微環(huán)境的轉(zhuǎn)變可能激活靜止的鱗狀上皮干細(xì)胞，這些干細(xì)胞侵入移行區(qū)的柱狀上皮或作為子宮內(nèi)膜內(nèi)的化生灶（圖 15)。從分子和細(xì)胞的角度來看，目前對維持宮頸上皮連接的機(jī)制的闡明提供了一個(gè)重要的概念進(jìn)展。這表明，這些部位的動(dòng)態(tài)平衡并不是通過一種上皮細(xì)胞類型向另一種上皮細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)分化來維持的。取而代之的是，成體組織類似于不同譜系特異性干細(xì)胞群體的整合，由微環(huán)境對外部或內(nèi)部信號做出反應(yīng)而激活。粘膜過渡區(qū)動(dòng)態(tài)平衡的這一概念與對粘膜干細(xì)胞鑒定的其他觀察結(jié)果非常吻合，并為將來在其他具有高度臨床意義的組織中研究過渡區(qū)動(dòng)態(tài)平衡提供了基礎(chǔ)。

▲圖 15  移行區(qū)和鱗狀化生期間的兩種上皮譜系和 Wnt-Notch 微環(huán)境

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