伯豪生物官網(wǎng)新消息，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)（ATAC-Seq 與 scRNA-Seq）在胚胎發(fā)育過(guò)程研究提供研究支持。

伯豪生物單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)服務(wù)面向科研領(lǐng)域與臨床領(lǐng)域工作者，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)服務(wù)哪家強(qiáng)，中國(guó)上海找伯豪。

在胚胎發(fā)育過(guò)程中，造血干細(xì)胞（HSCs）需要迅速分化為成熟的血細(xì)胞。當(dāng)前主要通過(guò)小鼠和體外模型系統(tǒng)來(lái)了解胎兒造血干 / 祖細(xì)胞（HSPCs）。研究表明在發(fā)育過(guò)程中，胎兒的造血功能包括不同器官中稀有造血干細(xì)胞的分化、遷移。人類(lèi)確定性造血作用始于背主動(dòng)脈造血簇中 HSCs 的出現(xiàn)，這些 HSCs 在 4  PCW 首先定位于胎兒肝臟并進(jìn)行擴(kuò)張，在 10.5 PCW 時(shí)，造血部位轉(zhuǎn)移至骨髓并建立成人造血功能。

近幾年的研究報(bào)道了在小鼠模型和成人中，通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記分離的數(shù)千個(gè)單個(gè)造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)具有異質(zhì)性。研究人員采用 scRNA-seq 技術(shù)對(duì)成人骨髓和胎兒肝臟造血進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn) HSCs 和多能祖細(xì)胞（MPP）的亞群具有協(xié)同表達(dá)的標(biāo)記基因；此外，成人骨髓表型 HSPCs 的 scATAC-seq 數(shù)據(jù)表明表型 MPPs 在染色質(zhì)可及性方面存在差異。然而 HSCs 潛在的命運(yùn)決定機(jī)制目前仍尚不清楚。

基于此，劍橋大學(xué)血液學(xué)系 Ana Cvejic 教授團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用 scRNA-seq 和 scATAC-seq 技術(shù)對(duì)來(lái)自胚胎肝臟和骨髓的 8,000 多個(gè)免疫表型 HSPCs 進(jìn)行綜合分析，探索人類(lèi)發(fā)育過(guò)程中造血功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。該項(xiàng)工作以“Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis”為題發(fā)表在 Cell Stem Cell 上。

圖片文章發(fā)表于 Cell Stem Cell

為獲取胚胎發(fā)育期間造血細(xì)胞的全部譜系，研究者從 17 – 22 PCW 的胚胎肝臟、股骨和髖骨中對(duì)表型確定的血液群體進(jìn)行單細(xì)胞分類(lèi)，并對(duì) 15 個(gè)胚胎的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 scRNA-seq 檢測(cè)（圖 1）。基于差異表達(dá)分析和標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)顯著性排名前 20 的標(biāo)記基因，標(biāo)注了 23 個(gè)不同的群體，發(fā)現(xiàn)在肝臟或股骨中檢測(cè)不到任何 T 細(xì)胞或先天淋巴細(xì)胞（ILCs），單細(xì)胞分析顯示在所有免疫表型定義的干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體中存在大量的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，其中一些表型祖細(xì)胞群體（如 HSCs，MPPs，CMPs，GMPs，MEPs 和 CLPs）由 10 多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄表型定義群體組成，這進(jìn)一步證明人類(lèi)臍帶血的祖細(xì)胞室具有高度的異質(zhì)性。此外，該研究分析表明當(dāng)前使用的細(xì)胞表面標(biāo)記物不能很好地預(yù)測(cè)人類(lèi)胚胎造血祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。

圖 1.  人類(lèi)胚胎造血的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。來(lái)源：Cell Stem Cell

接下來(lái)，研究者使用力導(dǎo)向圖繪制算法推斷了人類(lèi)胚胎發(fā)育期間造血細(xì)胞的分化軌跡。結(jié)果顯示 HSCs/MPPs 位于軌跡頂端，并且在 HSCs/MPPs 下游，研究者鑒定了三個(gè)高度增殖的寡能祖細(xì)胞群，即 MEMPs（紅系細(xì)胞、MKs 和肥大細(xì)胞）；GPs（粒細(xì)胞）；LMPs（淋巴樣細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞）。并使用 Scanpy 的 paga_path 函數(shù)顯示了沿三條分化途徑（MEMPs、GPs 和 LMPs）的譜系特異性基因動(dòng)態(tài)表達(dá)。然后利用 SCENIC 通過(guò)分化軌跡識(shí)別出 HSPCs 和成熟血細(xì)胞中 162 個(gè)調(diào)節(jié)子，其中 HLF 和 HOXA9 是 HSCs/MPPs 中的主要調(diào)節(jié)子，且 HSC/MPPs 簇在轉(zhuǎn)錄上為高度未成熟的細(xì)胞群。此外，研究者對(duì) HSCs/MPPs- cycle 和 HSCs/MPPs 進(jìn)行 DE 分析，結(jié)果顯示 HSCs/MPPs- cycle 增加了糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，除了 HSCs/MPPS-Cycle 簇中存在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)外，HSCs/MPPs 和 HSCs/MPPs-Cycle 之間沒(méi)有其它轉(zhuǎn)錄差異（圖 2）。

圖 2.  人類(lèi)胚胎造血細(xì)胞的分化軌跡。來(lái)源：Cell Stem Cell

由于技術(shù)限制，scRNA-seq 難以檢測(cè)低豐度轉(zhuǎn)錄本（如轉(zhuǎn)錄因子 TFs），而通過(guò)染色質(zhì)的可及性可推斷出這些 TFs 的活性，因此整合 scRNA-seq 和 scATAC-seq 方法具有重要意義。研究者利用 scATAC-seq 檢測(cè)了人類(lèi)胚胎 Lin- CD34+ CD38- 細(xì)胞的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性，分別對(duì) 18、20 和 21PCW 胚胎的肝臟和股骨中的 4,001 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序，基于 SNN 算法，共得到 7 個(gè)不同的可明顯分離的集群。此外，從 7 個(gè) scATAC-seq 集群中構(gòu)建了一個(gè)力導(dǎo)向圖，其軌跡顯示染色質(zhì)可及性與胚胎 HSCs / MPPs 分化之間存在明顯的趨勢(shì)。接下來(lái)，研究者使用 chromVAR 計(jì)算不同簇中可及性 TF 序列基序，沿著軌跡推斷確定的兩個(gè)分支，可觀察到譜系特異性造血 TF 基序的可及性的動(dòng)態(tài)變化（如 GATA1、TAL1、KLF1、HTF4、ID4、IRF8 和 TFE2），其中 GATA1 是紅系細(xì)胞、巨核細(xì)胞和肥大細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，且僅在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中的 MEMP 簇中表達(dá)；TAL1 有兩種不同的結(jié)合基序，在胎兒造血過(guò)程中，這兩種基序在不同的造血祖細(xì)胞中均具有活性；CEBPD 和 IRF8 的活性對(duì)髓系和樹(shù)突狀細(xì)胞的分化至關(guān)重要；ID4 和 HTF4 參與淋巴系的建立；這與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中的觀察結(jié)果一致（圖 3）。

圖 3.  人類(lèi)胚胎造血細(xì)胞的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性分析。來(lái)源：Cell Stem Cell

目前尚無(wú)人類(lèi)胚胎 HSPCs 的染色質(zhì)可及性圖譜，研究者基于基因體可及性繪制細(xì)胞圖譜來(lái)整合 scRNA-seq 和 scATAC-seq 數(shù)據(jù)。首先使用 6 種豐富的細(xì)胞類(lèi)型對(duì) scRNA-seq 實(shí)驗(yàn)中篩選出的 CD34+ CD38-  細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)果顯示 scATAC-seq 數(shù)據(jù)集中指定細(xì)胞類(lèi)型的頻率與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中的頻率高度一致，這表明染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組具有相關(guān)性。然而，不同類(lèi)型的細(xì)胞在整個(gè)軌跡上有相當(dāng)大的混合，如 HSCs/MPPs-Cycle 廣泛分布在七個(gè)集群中，這表明在 HSCs/MPP 群體中存在廣泛的染色質(zhì)啟動(dòng)，從而導(dǎo)致了異質(zhì)性。之后研究者比較了 7 個(gè)集群中 HSCs /MPPs 中選定的譜系特異性 TF 基序的可及性，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄同源的 HSCs/MPPs 集群中，一些先于基因表達(dá)的 TFs 的活性存在顯著差異（圖 4）。研究者進(jìn)一步探索分化過(guò)程中染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)之間的“時(shí)滯”，結(jié)果顯示在 HSCs/MPS 中，GATA1- 調(diào)節(jié)子靶基因的啟動(dòng)子在任何明顯基因表達(dá)之前均是開(kāi)放的，這證實(shí) HSCs/MPP 中染色質(zhì)的可及性早于轉(zhuǎn)錄變化。

圖 4. scRNA-seq 和 scATAC-seq 數(shù)據(jù)整合。來(lái)源：Cell Stem Cell

考慮到常用的分離純祖細(xì)胞群體分選標(biāo)記法的局限性，研究者基于細(xì)胞表面標(biāo)記設(shè)計(jì)了一種針對(duì) HSCs / MPP 的新的熒光激活細(xì)胞分選策略（簡(jiǎn)稱(chēng) CD-REF），使用 CD-REF 分選板對(duì)股骨 BM 細(xì)胞進(jìn)行分選，結(jié)果顯示標(biāo)記為 HSCs / MPP 和 HSCs / MPPs-Cycle 簇的 CD-REF 細(xì)胞約占 88%。為了評(píng)估 CD-REF 細(xì)胞譜系輸出的分化潛力和穩(wěn)健性，研究人員在小鼠 MS5 飼養(yǎng)層或更具生理相關(guān)性的人類(lèi)胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞（fMSCs）上對(duì)三個(gè)胎兒的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了分選，結(jié)果顯示 MS5 和 fMSCs 上分別存在著四系、三系、雙系、單系和未分化的譜系集落。接下來(lái)，又對(duì)單個(gè) CD-REF 和免疫表型 HSCs 進(jìn)行了分類(lèi)，結(jié)果顯示 CD-REF 在胎兒肝臟和骨髓中富集了多譜系輸出的細(xì)胞群，且 CD-REF 細(xì)胞具有與表型 HSCs 相當(dāng)?shù)亩酀撃苄院妥V系輸出能力，這與前述分化軌跡探究一致，再次驗(yàn)證 CD-REF 代表了高富集的 HSC/MPPs 群體（圖 5）。

圖 5.  改進(jìn)分選策略以分離胚胎 HSCs/MPPs。來(lái)源：Cell Stem Cell

HSC / MPP 簇中的細(xì)胞來(lái)源于肝臟，股骨和髖部，這為評(píng)估起源于胚胎肝臟或骨髓的 HSC/MPP 群體中潛在的定性和定量差異提供了機(jī)會(huì)。研究者首先對(duì)處于不同細(xì)胞周期狀態(tài)的肝臟和股骨細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行了 Fisher 高精度檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，在股骨和肝臟中，大多數(shù) CD-REF 細(xì)胞處于 G0/G1 期，而肝臟中處于 S -G2- M 期的細(xì)胞數(shù)量幾乎是股骨的兩倍。KS 和 MWW 檢驗(yàn)顯示，與肝臟相比，股骨中 HSCs/MPPS 中基因表達(dá)數(shù)量也比較少，但股骨中 HSCs/MPPs 顯著上調(diào)了與核小體組裝、染色質(zhì)組裝和 DNA 組裝有關(guān)的基因，而肝臟中 HSC/MPPs 顯著上調(diào)了與肌動(dòng)蛋細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞粘附和遷移有關(guān)的基因（圖 6）。

圖 6.  股骨和肝臟細(xì)胞在不同細(xì)胞類(lèi)型之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。來(lái)源：Cell Stem Cell

綜上所述，該研究提供了來(lái)自肝臟和骨髓的胚胎 HSPCs 的高分辨率轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性圖譜，為今后在血液病理學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的背景下研究人類(lèi)發(fā)育造血提供了重要參考。

參考文獻(xiàn)：

Ranzoni AM, Tangherloni A, Berest I, Riva SG, Myers B, Strzelecka PM, Xu J, Panada E, Mohorianu I, Zaugg JB, Cvejic A. Integrative Single-Cell RNA-Seq and ATAC-Seq Analysis of Human Developmental Hematopoiesis. Cell Stem Cell. 2020 Dec 15: S1934-5909(20)30553-1. doi: 10.1016/j.stem.2020.11.015. PMID: 33352111.

轉(zhuǎn)載：測(cè)序中國(guó)（侵刪）

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