單細胞 RNA-seq 技術已經在繪制器官基因表達譜研究中發揮了關鍵作用，但目前很難系統地鑒定和定位單個器官中所有分子細胞的類型，并創建完整的分子細胞圖譜。近期發表的研究成果中，多個細胞類型特異性標記分子被識別出來，為細胞類型的分子定義和功能研究提供了幫助。

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近日，美國斯坦福大學研究團隊利用單細胞 RNA-seq 分析創建了一個全面的成人肺分子細胞圖譜。該研究共對人類肺部組織和循環血液中的約 75,000 個細胞進行了測序，并結合多方面的細胞注釋方法，鑒定出肺部的 58 種細胞類型。該研究成果已發表在尖端期刊 Nature 上，文章題為“A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing”。

研究團隊獲取了人肺部的正常組織，包括支氣管（近端）、細支氣管（中端）和肺泡（遠端）區域以及外周血。樣本處理成細胞懸液后，被分為上皮細胞（EPCAM+）、內皮細胞 / 免疫細胞（CD31+/CD45+）和基質細胞（EPCAM-、CD31-、CD45-）。該研究利用 10x Chromium 發現罕見細胞類型，再通過 SmartSeq2 獲得更深入的轉錄信息。通過基于液滴和孔板的單細胞 RNA 測序（droplet- and plate-based single-cell RNA sequencing），研究團隊對所有肺組織間室和循環血液中的約 75,000 個細胞進行了測序，結合多種細胞注釋方法，繪制了一個全面的人肺分子細胞圖譜。

該圖譜揭示了人類肺部 58 個細胞群的基因表達譜和解剖位置，包括 45 種已知細胞類型中的 41 種和 14 種未知細胞類型。這 58 種分子類型細胞包括 15 種上皮細胞，9 種內皮細胞，9 種基質細胞和 25 種免疫細胞。

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▲圖 1. 通過迭代聚類發現組織細胞的 scRNA-seq 譜。來源：Nature

該圖譜定義了幾乎所有典型肺細胞類型（91%）的全基因組表達譜，從豐富的（毛細血管，約占肺細胞的 23%）到極其罕見的（離子細胞，約占 0.01%）。其中，1/ 4 的細胞類型此前缺乏高質量的單細胞轉錄組。同時，研究團隊通過對 21 種已分類的人類血細胞進行 RNA 測序，定義了循環免疫細胞的轉錄譜。在肺和血液單細胞 RNA-seq 分析中，使用了典型免疫標記和差異表達基因 panel 來分配 25 個免疫細胞簇。

▲圖 2. 人類肺免疫分子類型聚集與注釋。來源：Nature

該分子圖譜可鑒定肺細胞的生化功能和轉錄因子標記。分析發現，三組細胞簇（增殖基底 v 細胞、增殖自然殺傷 / T 細胞、增殖巨噬細胞）的周期基因表達豐富，表明它們是 zuì富增殖能力的肺細胞類型。研究發現了兩簇肺泡 2 型（AT2）細胞，可以產生表面活性物質，防止肺泡塌陷。這些細胞混雜在肺泡上皮中。此外，研究團隊在肺內皮腔內發現了意想不到的分子多樣性，并鑒定了新基質類型。兩個簇表達經典成纖維細胞標記物（BSG 和 COL1A2），其中一個簇定位于肺泡，另一個簇定位于血管外膜和鄰近氣道。

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▲圖 3. AT2 標記表達的點圖（10x 數據集）與 smFISH 和細胞定量評分。來源：Nature

利用該圖譜，研究團隊確定了受肺部疾病基因和呼吸道病毒直接影響的細胞類型，并分析了 233 個現存肺部疾病基因的表達數據，可以確定疾病的細胞起源。該數據可支持 12 種疾病 27 個基因的已知或疑似“罪魁禍首”細胞，并確定了 15 種疾病涉及 21 個基因的細胞類型，包括肺動脈高壓的周細胞、房室發育不良的毛細血管和慢性阻塞性肺病（COPD）的 AT2 細胞。同時，該圖譜還繪制了 80 個編碼病毒受體基因的表達情況，其中包括呼吸道病毒的 26 個基因。

通過比較人類和小鼠的數據，該研究確定了 17 種在肺進化過程中獲得或丟失的分子細胞類型，及表達譜發生重大變化的分子細胞類型，揭示了細胞類型和細胞類型特異性基因表達在器官進化過程中的廣泛可塑性，包括細胞類型之間的表達轉換。

▲圖 4. 肺細胞類型和表達模式的進化差異。來源：Nature

研究團隊表示，這是一項艱巨的挑戰，因為不同細胞類型具有不同的結構、位置和豐度，其變化范圍超過 5 個數量級。該分子細胞圖譜可為監測肺部所有細胞類型以及它們在發育、衰老、疾病和進化過程中如何變化提供標記和基準，以及為研究肺細胞功能和相互作用提供了分子基礎，將對肺相關生理學和醫學研究產生廣泛影響。

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