10x Genomics 在分析軟件這一塊還是非常給力的，開(kāi)發(fā)的每個(gè)軟件都非常好用而且操作簡(jiǎn)單，特別是安裝方便，基本解壓后就能用。對(duì)于 10x 的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)主要用 10x 自己開(kāi)發(fā)的 Space Ranger 來(lái)進(jìn)行前期的處理。
軟件下載地址
https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest
可以直接點(diǎn)擊下載，也可以用下面的 curl 或 wget 命令下載。
基因組下載
在前面同一個(gè)頁(yè)面往下拉就能看到。
10x 提供了專門(mén)的用于空間轉(zhuǎn)錄組分析的基因組，目前較新的基因組版本是 2020 年 6 月更新的，基因注釋為 Ensembl 98 版本，主要包括人和小鼠。
系統(tǒng)要求
Linux 系統(tǒng)上運(yùn)行底限要求：
8 核 Intel 或 AMD 處理器（建議使用 32 核）
64GB RAM（建議 128GB）
1TB 可用磁盤(pán)空間
64 位 CentOS / RedHat 6.0 或 Ubuntu 12.04
集群模式下運(yùn)行需要額外滿足以下要求：
每個(gè)節(jié)點(diǎn) 8 核 Intel 或 AMD 處理器
每個(gè)內(nèi)核 6GB RAM
共享文件系統(tǒng)（例如 NFS）
SGE 或 LSF 批處理系統(tǒng)
軟件安裝
1，解壓 SpaceRanger 文件
1 tar -xzvf spaceranger-1.1.0.tar.gz
2，解壓參考基因組文件
1 tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
3，加入環(huán)境變量
1 export PATH=/opt/spaceranger-1.1.0:$PATH
輸入文件準(zhǔn)備
Fastq 序列文件
10x 建議測(cè)序 read2 設(shè)置 90 個(gè)堿基的長(zhǎng)度 。 從下面 10x 測(cè)試的 6 個(gè)樣本來(lái)看，reads 序列長(zhǎng)度達(dá)到 70bp 以后，mapping 率就不太變化了，有些樣本在長(zhǎng)度大于 90bp 以后 mapping 率反而下降了。10x 給出這樣的建議是考慮到建庫(kù)后插入片段太短的話，太長(zhǎng)的序列里面會(huì)包含部分 polyA 甚至 UMI 序列反而影響比對(duì)效果。 因?yàn)閲?guó)內(nèi)目前基本上是測(cè) 2x150bp 的，如果建庫(kù)片段過(guò)短比對(duì)率較低的話建議將 read2 剪切成 90bp 來(lái)分析效果應(yīng)該會(huì)好一點(diǎn)。
Fastq 文件名建議是如下格式的，以免運(yùn)行報(bào)錯(cuò)。
圖像文件：
Space Ranger 支持兩種樣式的顯微鏡圖像：用蘇木精和曙紅（H&E）染色的明場(chǎng)圖像，必須是 24 位彩色 TIFF，16 位灰度 TIFF 或 JPEG。Space Ranger 要求任一方向上的圖像至少為 2000 像素。
注意：圖像邊框的四個(gè)角位置是固定的，比如說(shuō) 三角形在左下角 ，如果掃描出來(lái)的圖片四個(gè)角的位置變了需要先手動(dòng)調(diào)整過(guò)來(lái)再使用。
軟件運(yùn)行
一般我們拿到的都是直接是 fastq 序列文件了，所以可以直接跑 spaceranger count，不需要再去運(yùn)行 spaceranger mkfastq 了。
spaceranger count 運(yùn)行時(shí)圖片對(duì)其有兩種方式，一種軟件自動(dòng)識(shí)別圖片進(jìn)行對(duì)齊，另外一種就是先用 Loupe 軟件手動(dòng)對(duì)齊，生成對(duì)于 json 文件提供給后面的軟件，后期會(huì)介紹怎么來(lái)手動(dòng)調(diào)整圖片。
自動(dòng)對(duì)齊
1 $ cd /home/jdoe/runs
2 $ spaceranger count --id=sample345 \
3 --transcriptome=/opt/refdata/GRCh38-3.0.0 \
4 --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
5 --sample=mysample \
6 --image=/home/jdoe/runs/images/sample345.tif \ 7
7 --slide=V19J01-123 \
8 --area=A1
手動(dòng)對(duì)齊
1 $ cd /home/jdoe/runs
2 $ spaceranger count --id=sample345 \
3 --transcriptome=/opt/refdata/GRCh38-3.0.0 \
4 --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
5 --sample=mysample \
6 --image=/home/jdoe/runs/images/sample345.tif \
7 --slide=V19J01-123 \
8 --area=A1 \
9 --loupe-alignment=sample345.json
參數(shù)說(shuō)明：
--Id：結(jié)果輸出文件夾名稱
--Transcriptome：基因組目錄
--Fastqs：fastq 文件木蘭路
--Sample：原始樣本名
--Image：鏡像圖片文件
--Slide：使用的 10x 芯片型號(hào)
--area：樣本所在芯片的區(qū)域（四通道芯片位置從上到下分別為 A1、B1、C1、D1）
--loupe-alignmen: 圖片手動(dòng)對(duì)齊生成的 json 文件，如果是自動(dòng)對(duì)齊不要需要此參數(shù)
另外，spaceranger 默認(rèn)使用系統(tǒng)上可用的所有內(nèi)核來(lái)執(zhí)行管。可以使用 --localcores 選項(xiàng)來(lái)限制使用內(nèi)核的數(shù)量。同理，可以使用 -localmem 來(lái)限制使用內(nèi)存的大小。
結(jié)果輸出：
成功運(yùn)行后會(huì)到的下面的信息（包括主要的輸出文件）
1 2016-11-10 16:10:09 [runtime] (join_complete) ID.sample345.SPATIAL_RNA_COUNTER_CS.SPATIAL_RNA_COUNTER_CS.SUMMARIZE_REPORTS 2
2
3 Outputs:
4 - Run summary HTML: /opt/sample345/outs/web_summary.html
5 - Outputs of spatial pipeline: /opt/sample345/outs/spatial
6 - Run summary CSV: /opt/sample345/outs/metrics_summary.csv
7 - BAM: /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam
8 - BAM index: /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
9 - Filtered feature-barcode matrices MEX: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix
10 - Filtered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
11 - Unfiltered feature-barcode matrices MEX: /opt/sample345/outs/raw_feature_bc_matrix
12 - Unfiltered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/raw_feature_bc_matrix.h5
13 - Secondary analysis output CSV: /opt/sample345/outs/analysis
14 - Per-molecule read information: /opt/sample345/outs/molecule_info.h5
15 - Loupe Browser file: /opt/sample345/outs/cloupe.cloupe
16
17 Pipestance completed successfully!
空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)優(yōu)勢(shì)
高質(zhì)量切片： 切片、貼片經(jīng)驗(yàn)豐富，針對(duì)不同組織優(yōu)化了解決方案。
流程化分析： 完善的分析流程，準(zhǔn)確快速解析空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。
標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)控： 豐富的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)控體系。
專業(yè)化團(tuán)隊(duì)： 資深的技術(shù)團(tuán)隊(duì)具有多年項(xiàng)目方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、售后分析等經(jīng)驗(yàn)。
全流程服務(wù)： 提供組織冷凍包埋、貼片、切片、透化、建庫(kù)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析的全套服務(wù)。
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