精子的生成在時(shí)間和空間上有著復(fù)雜而有序的過程。現(xiàn)代社會(huì)男性生殖障礙的比例越來越高，而不 育癥的男性患上睪丸癌和前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)比正常男性更高 [Guo J et al. Cell Stem Cell. 2017]。

1）對(duì)精子進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，有助于了解精子成熟過程中基因重組的特征。Lu S 等人使用多次退火 循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（MALBAC[Hou Y et al. Cell. 2013])，對(duì)精子進(jìn)行單細(xì)胞全基因組 DNA（scDNA-seq）測(cè) 序，實(shí)現(xiàn)了高覆蓋度的單精子的全基因組測(cè)序 [Lu S et al. Science. 2012]。Hinch AG 等人對(duì)小 鼠精子進(jìn)行 scDNA-seq，繪制了精子的高分辨率交叉圖譜和重組階段的特異性分子特征 [Hinch AG et al. Science. 2019]。

2）從單細(xì)胞水平上重建精子發(fā)育過程中細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)順序，對(duì)破譯男性相關(guān)的生殖障礙 有著重要的意義。Guo J 等人利用 scRNA-seq 的方法，從單細(xì)胞層面上描繪了精子干細(xì)胞在正常發(fā) 育過程中所經(jīng)歷的多階段過程，同時(shí)從基因角度詮釋了男性不育癥的原因 [Guo J et al. Cell Stem Cell. 2017]。此外，Wang M 等人對(duì)正常成年男性和梗阻性無精癥患者的睪丸組織進(jìn)行了 scRNA-seq，從單細(xì)胞角度闡明了人類精子發(fā)生過程中的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞轉(zhuǎn)變（cell fate transition）的路徑，為無精癥的分子診斷和臨床治療提供了全新的視角 [Wang M et al. Cell Stem Cell. 2018]。

圖  2-1  基于  MALBAC  擴(kuò)增進(jìn)行單細(xì)胞全基因組  DNA  測(cè)序的基本流程

[Hou Y et al. Cell. 2013]

3）對(duì)精子進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序也有助于探索疾病機(jī)制。一項(xiàng)研究顯示，對(duì)有正常后代及自閉癥后代的   人類男性精子進(jìn)行單細(xì)胞 DNA 和 RNA 測(cè)序，從單細(xì)胞水平鑒定精子是否發(fā)生自閉癥相關(guān)的基因變異及基因表達(dá)差異 [Tomoiaga D et al. NPJ Genom Med. 2020]，發(fā)現(xiàn)精子中確實(shí)存在遺傳變異。這可   用于分析單個(gè)精子細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)和突變動(dòng)力學(xué)，為疾病機(jī)制提供更深層次的見解。

卵子是人體大的細(xì)胞，在單細(xì)胞研究中有著天然的優(yōu)勢(shì)。卵細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序可用于研究卵子發(fā)育過程及卵巢疾病對(duì)卵子發(fā)育的影響。

1）從單細(xì)胞水平上研究卵細(xì)胞成熟的原理。Zhao H 等人通過對(duì)體外成熟和體內(nèi)成熟的卵細(xì)胞進(jìn)行 scRNA-seq 發(fā)現(xiàn) [Zhao H et al. Antioxid Redox Signal 2019]，代謝通路的改變是體內(nèi)外成熟卵母   細(xì)胞的典型差異，代謝通路關(guān)鍵分子 ACAT/HADHA-DPYD 有助于維持卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。

2）單細(xì)胞測(cè)序可以探索激素導(dǎo)致的排卵異常。小鼠卵母細(xì)胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn) [Wang H et al. Nat Commun. 2019]，組蛋白去乙酰化酶可以促進(jìn)體外卵母細(xì)胞的成熟，為解析女性不孕提供新的方向。3）單細(xì)胞測(cè)序可用于探索卵巢相關(guān)疾病對(duì)卵細(xì)胞發(fā)育的影響。對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病人的卵細(xì)   胞和健康人卵細(xì)胞進(jìn)行 scRNA-seq[Ferrero H et al. Hum Reprod. 2019]，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的一些基因與卵細(xì)胞的低質(zhì)量有關(guān)，證實(shí)了卵巢疾病與女性不孕的相關(guān)性。

4）單細(xì)胞測(cè)序研究卵巢衰老機(jī)制。2020 年 3 月，北京大學(xué)湯富酬教授課題組與合作者利用高   精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù) [Si Wang et al. Cell, 2020]，繪制了食蟹猴卵巢的單細(xì)胞衰老圖譜；同時(shí)利用人類卵巢細(xì)胞研究體系，發(fā)現(xiàn)增齡伴隨的抗氧化能力的下降是靈長(zhǎng)類卵巢衰老的主要特征之   一。該項(xiàng)研究在單細(xì)胞分辨率下更為高精度地揭示靈長(zhǎng)類動(dòng)物卵巢衰老的機(jī)制之一，確定了人類及其他   靈長(zhǎng)類動(dòng)物卵巢衰老的生物標(biāo)志物，為開發(fā)延緩卵巢衰老及相關(guān)疾病的干預(yù)策略奠定了理論基礎(chǔ)。

人類胚胎在前兩個(gè)月是容易流產(chǎn)的時(shí)期。對(duì)胚胎細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序，有助于探索胚胎的發(fā)育機(jī)制和影響胚胎發(fā)育的因素，為保障胚胎正常發(fā)育提供理論支持。

1）單細(xì)胞測(cè)序探索胚胎早期發(fā)育機(jī)制。湯富酬實(shí)驗(yàn)室和北醫(yī)三院?jiǎn)探軐?shí)驗(yàn)室合作通過對(duì)人類體外   培養(yǎng)受精卵進(jìn)行單細(xì)胞 DNA 或 RNA 測(cè)序 [Zhou F et al. Nature. 2019]，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞在植入后會(huì)更   快地發(fā)生甲基化。小鼠、斑馬魚和青蛙早期胚胎的單細(xì)胞研究深刻地展示了胚胎發(fā)育中一些關(guān)鍵性過   程（表 2-4）。

表 2-4  部分胚胎發(fā)育領(lǐng)域的單細(xì)胞研究

2）評(píng)估環(huán)境因素對(duì)胚胎發(fā)育的影響。對(duì)有無尼古丁下人類胚胎干細(xì)胞衍生的胚狀體進(jìn)行 scRNA-seq 發(fā)現(xiàn) [Guo H et al. Stem Cell Reports 2019]，尼古丁誘導(dǎo)胚狀體細(xì)胞系發(fā)生特異性反應(yīng)和細(xì)胞間通   訊失調(diào)，提示尼古丁對(duì)胚胎干細(xì)胞分化有直接的不良影響，為評(píng)價(jià)藥物和環(huán)境毒性對(duì)人胚胎發(fā)育的影   響提供了一種新的方法。

單細(xì)胞技術(shù)有助提高試管嬰兒成功率。試管嬰兒是重要的輔助生殖手段，目前已經(jīng)發(fā)展到第四代，總體活胎分娩率在 40% 左右，不同試管嬰兒技術(shù)所對(duì)應(yīng)的適應(yīng)癥和成功率均不相同，第三代以前整體成   功率僅約為 35%。從第三代開始，加入了胚胎植入前的遺傳學(xué)診斷，使整體成功率大幅提高（約 80%）。目前，胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（PGS）和胚胎植入前遺傳診斷（PGD）主要使用的技術(shù)有兩種，都與單細(xì)   胞技術(shù)相關(guān)：MALBAC（以及更新的 LIANTI 技術(shù)）和 MDA（多重置換擴(kuò)增），分別由北京大學(xué)、北醫(yī)三院  [Huang J et al. Fertil Steril. 2014] 和華大基因 [Xu Y et al. Clin Chem. 2015]  主導(dǎo)研發(fā)，顯   示了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在植入前遺傳學(xué)診斷臨床實(shí)踐中的潛力。

此外，體外成熟的卵母細(xì)胞發(fā)育潛能較差，流產(chǎn)率相對(duì)較高，且尚無有效改善措施。基于單細(xì)胞測(cè)   序?qū)w內(nèi)外成熟的卵細(xì)胞進(jìn)行比較，為輔助生殖的持續(xù)優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ) [Zhao H et al. Antioxid Redox Signal 2019]。

目前而言，受限于價(jià)格昂貴、大眾認(rèn)知不足、臨床應(yīng)用不成熟以及監(jiān)管嚴(yán)格（表 2-5)，基于單細(xì)胞   技術(shù)的輔助生殖在我國的應(yīng)用并不廣泛，相關(guān)產(chǎn)業(yè)還有很大的上升空間。

表  2-5  國內(nèi)十三家，首批擁有胚胎植入前篩查資質(zhì)的醫(yī)院統(tǒng)計(jì)

孕婦血漿中胎兒游離細(xì)胞以及單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，為單細(xì)胞的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了可能。日本科研 人員從母體外周血樣本中提取了游離的胎兒 CD45-CD14 細(xì)胞 [Sato T et al. J Mol Diagn 2020]，使   用 scDNA-seq 對(duì)男女胎兒的遺傳信息進(jìn)行了識(shí)別，展現(xiàn)了單細(xì)胞無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的潛力。目前單細(xì)胞無   創(chuàng)產(chǎn)前診斷尚未進(jìn)入臨床階段。

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