發(fā)表期刊：J Clin Invest

影響因子：IF=11.57

伯豪公司提供的產(chǎn)品或服務(wù)：Human circRNA 芯片

尿病視網(wǎng)膜病變（DR) 是處于工作年齡的成年人失明的主要原因。其中，血管周細(xì)胞變性是主要的臨床表現(xiàn)。然而，控制周細(xì)胞變性的機(jī)制卻不明確。環(huán)狀 RNA (Circular RNAs, circRNAs) 已被發(fā)現(xiàn)在多種生物過程和疾病進(jìn)展中起重要作用。本研究中，作者研究了 circRNA 在周細(xì)胞生物學(xué)和糖尿病視網(wǎng)膜血管中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者外周血細(xì)胞中 cZNF532 表達(dá)上調(diào)；在糖尿病小鼠模型的視網(wǎng)膜血管中和糖尿病患者的玻璃體中，cZNF532 表達(dá)也同樣上調(diào)。進(jìn)一步分析其功能發(fā)現(xiàn)，cZNF532 沉默會導(dǎo)致周細(xì)胞的存活率，增殖和和分化能力降低。在體外實(shí)驗中，cZNF532 還可以抑制周細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的募集。cZNF532 可以作為 miR-29a-3p 海綿并誘導(dǎo) NG2，LOXL2, CDK2 的表達(dá)來調(diào)控周細(xì)胞生物學(xué)功能。下調(diào) cZNF532 或過表達(dá) miR-29a-3p 加重鏈脲霉素誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞變性和血管功能障礙。相反，過表達(dá) cZNF532 或抑制 miR-29a-3p 可改善糖尿病玻璃體誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞變性和血管功能障礙。總的來說，該研究證實(shí)了 circRNA 在 DR 中介導(dǎo)的周細(xì)胞生物學(xué)的機(jī)。誘導(dǎo) cZNF532 或拮抗 miR-29a-3p 可能成為將來治療 DR 的新方法。

結(jié)果

1. 在周細(xì)胞中，高糖可以顯著上調(diào)環(huán)狀 RNAcZNF532 的表達(dá)

通過 circRNA 芯片檢測高糖處理和正常對照的周細(xì)胞的 circRNA 表達(dá)，共篩選到 1523 顯著差異表達(dá)的 circRNAs，其中包含 625 個上調(diào)的 circRNAs 和 898 個下調(diào)的 circRNAs。通過 qPCR 進(jìn)一步驗證 top5 上調(diào)和 top5 下調(diào)的 circRNAs 發(fā)現(xiàn)，circ_0047814 是上調(diào)較多的 circRNA。該 circRNA 是由 ZNF532 轉(zhuǎn)錄而來的。Sanger 測序確定其在周細(xì)胞中為組成型表達(dá)。該 circRNA 可以抵御 Rnase 酶的消化。并且發(fā)現(xiàn)該 circRNA 主要在周細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，預(yù)示著其可能會作為 ceRNA，來參與周細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)控。動物實(shí)驗和細(xì)胞實(shí)驗同樣證實(shí)了 cZNF532 在高糖誘導(dǎo)下會顯著上調(diào)。

為了進(jìn)一步確認(rèn) cZNF532 的調(diào)控機(jī)制，作者運(yùn)用 TRANSFAC database 進(jìn)行上游轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測，結(jié)果顯示，其有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中包括與糖尿病的發(fā)病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 SP1.

2. 體外實(shí)驗證實(shí) cZNF532 可以調(diào)節(jié)周細(xì)胞功能

周細(xì)胞是多能的干細(xì)胞和 / 或祖細(xì)胞，可以分化為多種不同的細(xì)胞類型。cZNF532 siRNA1 沉默 cZNF532 降低了周細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，包括血小板衍生生長因子受體（PDGFR)- 細(xì)胞增殖、血清 - sma、Desmin 和 NG2(圖 2A)。周細(xì)胞 - 內(nèi)皮細(xì)胞的 corsstalk 對血管穩(wěn)態(tài)的穩(wěn)定至關(guān)重要。而且內(nèi)皮細(xì)胞屏障的正常功能需要周細(xì)胞募集。基質(zhì)共培養(yǎng)檢測顯示，cZNF532 沉默降低了 HRVECs 周細(xì)胞募集（圖 2B)。與對照組相比，周細(xì)胞 cZNF532 沉默增加了大分子的通透性。然后作者確定異常的周細(xì)胞分化和募集是否與改變細(xì)胞活力或增殖有關(guān)。MTT 和 Ki67 染色顯示，沉默 cZNF532 降低了周細(xì)胞的活力和增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與野生型對照組相比，沉默 cZNF532 周細(xì)胞 S 期細(xì)胞減少 3 倍，g1 期細(xì)胞增加約 30%。PI 染色和 caspase 3/ 7 活性檢測顯示，沉默 cZNF532 可加重高糖或氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為 caspase 3/ 7 活性增加，PI 陽性細(xì)胞增多。

3.cZNF532 在體內(nèi)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜周細(xì)胞功能和血管完整性

單獨(dú)沉默 cZNF532 (cZNF532 shRNA) 或單獨(dú)糖尿病（DR) 可在 2 個月、4 個月和 6 個月時降低視網(wǎng)膜周細(xì)胞的覆蓋。合并 cZNF532 沉默和糖尿病進(jìn)一步降低了視網(wǎng)膜周細(xì)胞的覆蓋。結(jié)果表明，cZNF532 沉默和糖尿病協(xié)同調(diào)節(jié)周細(xì)胞的覆蓋。采用 Evans 藍(lán)法檢測視網(wǎng)膜血管滲漏。在 1 個月、2 個月、4 個月和 6 個月時，作者發(fā)現(xiàn)實(shí)驗因素 cZNF532 沉默和糖尿病協(xié)同加重糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管滲漏，這與 cZNF532 調(diào)整周細(xì)胞覆蓋的結(jié)果相似。

4.cZNF532 在體外作為 miR-29a-3p 的海綿調(diào)節(jié)周細(xì)胞功能

由于 cZNF532 主要表達(dá)在周細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，作者推測 cZNF532 在轉(zhuǎn)錄后水平上作為 miRNA 海綿調(diào)控周細(xì)胞功能。作者通過 TargetScan 算法，尋找 Cznf532 所能吸附的 miRNA。熒光素酶活性篩選顯示，miR-29a-3p、miR-498 和 miR-758 模擬轉(zhuǎn)染降低熒光素酶活性 LUC-cZNF532。FISH 檢測顯示，cZNF532 和 miR-29a-3p 在周細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中重疊共表達(dá)。進(jìn)一步采用熒光素酶活性測定法研究 cZNF532 能否與 miR-29a-3p 結(jié)合。過表達(dá) cZNF532 或 anti-miR-29a-3p 逆轉(zhuǎn)了 mir -29a-3p 介導(dǎo)的對熒光素酶活性的抑制。而不能產(chǎn)生 cZNF532 的 cZNF532 載體由于 cZNF532 產(chǎn)量低或循環(huán)效率低，影響較小。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染 miR-29a-3p inhibitor 或 mimic 并沒有改變周細(xì)胞中 cZNF532 和 ZNF532 mRNA 的表達(dá)。這些結(jié)果表明，cZNF532 只是作為 miR-29a-3p 的海綿，通過將 miR-29a-3p 從其靶基因中隔離出來，從而降低 miR-29a-3p 的活性。

5.cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2 網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)周細(xì)胞功能和血管完整性

然后作者在體內(nèi)研究了 miR-29a-3p 在視網(wǎng)膜血管功能障礙中的作用。miR-29a-3p agomir 或 cZNF532 沉默導(dǎo)致 NG2 和 CDK2 表達(dá)增加。miR-29a-3p agomir 可模擬沉默 cZNF532 對視網(wǎng)膜血管功能障礙的影響。在糖尿病視網(wǎng)膜中，注射 miR-29a-3p agomir 降低了周細(xì)胞的覆蓋，加重了血管滲漏（圖 6C 和 6D)，增加了微動脈瘤、脫細(xì)胞毛細(xì)血管和周細(xì)胞影。

結(jié)論

該研究證實(shí)了 circRNA 在 DR 中介導(dǎo)的周細(xì)胞生物學(xué)的機(jī)制，誘導(dǎo) cZNF532 或拮抗 miR-29a-3p 可能成為將來治療 DR 的新方法。

參考文獻(xiàn)

Jiang, Q., et al., Circular RNA-ZNF532 regulates diabetes-induced retinal pericyte degeneration and vascular dysfunction. J Clin Invest, 2020.

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