越來越多的證據表明，阿爾茨海默氏病（AD) 是一種普遍的代謝性疾病，發病機理涉及多種生化途徑的失調。目前對 AD 的治療方法為抗淀粉樣 β(Aβ) 蛋白療法，但是該方法治愈率低。所以確定 AD 發病機制的新靶點對于開發有效的治療方法至關重要。過去的研究表明，膽堿相關生化途徑的異常可能與阿爾茨海默病的發病機制有關，特別是轉甲基化、多胺合成 / 分解代謝和相關途徑。本文研究者檢驗了大腦中膽堿相關的生化途徑失調與 AD 發病機制有關的假說；他們在以下 6 個類別中研究了與轉甲基化和多胺合成 / 分解代謝相關的生化反應中的代謝物：蛋氨酸循環，轉硫和谷胱甘肽合成，多胺合成 / 分解代謝，尿素循環，谷氨酸 - 天冬氨酸代謝和神經遞質代謝，利用毛細管電泳質譜法（CE-MS) 對這些類別中可用的代謝物進行分析。然后利用 GEO 中的轉錄組數據集以檢驗這些通路的遺傳調節因子的基因表達是否在已知 AD 病理積累觸發認知障礙發作的大腦區域發生了變化。
實驗方法
樣本組織：人腦組織【大腦區域：顳下回（ITG)，額中回（MFG)，小腦（CB)】
檢測方法：靶向代謝組檢測
檢測平臺：CE-MS
樣本分組：分為 3 組，分別為 AD 組（n=17）、ASY 組（n=13）、CN 組（n=13）
分析流程
1. CE-TOFMS data(n=43) 進行靶向代謝組分析，篩選差異代謝物。
2. 通過 GEO datasheet【內嗅皮層（ERC) 區：AD 組 =25,CN 組 = 52; 海馬（HIP) 區：AD 組 =29,CN 組 =56】驗證通路中調節因子的基因表達的變化情況。
主要結果
代謝組分析
研究者通過取得捐贈者的腦組織進行靶向代謝的定量檢測，從 130 種可定量的代謝物中預先確定了 27 種差異代謝物，它們代表了轉甲基化和多胺途徑中的反應物，其中由于 1 個代謝物的 Missing value 超過 30%，所以被剔除。檢測結果如表 1(僅顯示 9 個代謝物的信息）。26 種差異代謝物涉及的生化途徑一共 6 條：蛋氨酸循環、轉硫和谷胱甘肽合成、多胺的合成和分解代謝、尿素循環、谷氨酸 - 天冬氨酸代謝、神經遞質代謝。
表 1 CE-TOFMS 檢測的局部腦組織代謝物濃度（pmol/mg)
研究者采用 R -Studio1.1.453 和 STATA16.0 軟件進行分析。使用 α 值 0.05 來確定統計學意義。同時進行了多重比較方法 Benjamini-Hochberg 錯誤發現率（FDR=0.05）和 bonferoni 校正（FWER=0.05）。兩種比較方法均校正了 52 種比較（26 種代謝物×2 個主要腦部區域 ITG 和 MFG），這些比較是基于它們對不同 AD 病理的易感性而預先指定的。檢查了三組（AD，ASY 和 CN）在性別，APOEε4 攜帶者狀態（Fisherexact 試驗），年齡和驗尸間隔（PMI）（Kruskal-Wallis 測試）方面的差異樣。信息如表 2：
表 2 BLSA 尸檢樣本的人口統計學特征
本研究的主要分析不同組之間代謝物水平的差異，研究者在兩個主要大腦區域 ITG,MFG 以及次級控制區域 CB 中的預先定義代謝物類別用線性混合效應模型，其中以 log2 轉換濃度作為因變量，組作為固定效應，非結構化的組內殘差相關性，Huber-White 穩健方差估計，然后使用的相同的方法，僅針對主要大腦區域（即 ITG 和 MFG），分析腦組織代謝物與 Braak 和 CERAD 病理評分的相關性。利用廣義估計方程（GEE）聚類分析和獨立 Kruskal-Wallis 檢驗的非參數 Spearman 相關進行敏感性分析，得到了相似的結果（圖 1 -3）。
圖 1 為可視化代謝物變化方向和影響大小的森林圖。表明不同組之間的顯著代謝物濃度差異。圖 2 顯示了代謝物濃度和神經斑塊負荷（即 CERAD 評分）之間的關聯。圖 3 顯示了代謝物濃度和神經原纖維病理學（即 Braak 評分）之間的關聯。圖 1 - 3 中綠色表示 AD 中代謝物濃度較低，與 AD 病理呈負相關；紅色表示表示 AD 中代謝物濃度較高，與 AD 病理呈正相關。
圖 1 類別特異性代謝物濃度的組間差異
圖 2 類別特異性代謝物與神經癥性斑塊負荷（CERAD) 的關聯
圖 3 特定類別代謝物與神經原纖維病理學（Braak）之間的關聯
基因表達分析
表 2 列出了在三個 GEO 數據集中有基因表達數據的參與者的人口統計學特征。在 GEO 數據中，AD 參與者明顯比 CN 參與者年齡大（p<0.05)。BLSA 參與者和 GEO 參與者沒有性別差異；BLSA 參與者明顯比 GEO 參與者年齡大（p<0.05)。
表 3 來自 GEO 數據的參與者人口統計
對于基因表達數據，首先使用 Robust Multi-array Average(RMA) 和 Brainarray ENTREZG（version 22）自定義 CDF 對樣本進行歸一化。利用 GEO 數據集 GSE48350、GSE5281 和 GSE8442，并使用 GEO 數據集名稱對所有的批次協變量進一步統計分析。然后使用 one-way ANOVA test 測試 AD 和 CN 樣本在性別、年齡和批次上的差異。利用 R 包 limma 檢測 AD 和 CN 樣本之間的單個基因的單變量差異，控制性別、年齡和批次的影響，并使用 FDR(p=0.05) 調整 GEO 數據集中使用的 Affymetrix U133 Plus 2.0 數組中的所有的 20414 個基因的多重比較。總結了性別、年齡和成批校正的倍數變化結果。
為了確認 ERC 和 HIP 中的區域基因表達與進行代謝組學測定的 ITG 和 MFG 中的基因表達相關性，研究者檢測了在顳下和中額葉皮層中檢測的 71 個基因中的區域基因表達變化，ITG 中的區域基因表達與 HIP 區（p=0.455,p=5.9×10-5) 和 ERC(p=0.260,p=0.0276) 顯著相關，MFG 中的區域基因表達也顯著相關（HIP 區 p =0.512，p=4.19×10-6;ERC 區：p=0.344,p=0.0031）。
甲基化和多胺途徑相關的生化反應的六個類別中的 33 個基因（FDR 校正的 p 值 <0.05）中，AD 和 CN 的 ERC /HIP 區域的基因表達水平發生了變化。使用 FDR 校正多次后，AD 和 CN 樣品之間基因表達的這些差異具有統計學意義，與 CN 相比，圖 4 總結了 AD 患者的 HIP/ERC 中與轉甲基化和多胺代謝相關的所有六類生化反應的差異表達基因。灰色表示 AD 患者和對照組的基因表達沒有顯著差異。
圖 4 ERC 和海馬區差異基因表達熱圖
特定代謝途徑中代謝物濃度和基因表達變化
本研究者先前的研究表明了 AD 中的糖酵解、脂肪酸和磷脂代謝的異常，本研究則發現了研究了轉甲基化途徑（一碳單位的主要代謝來源）和密切相關的多胺合成 / 分解代謝途徑的失調與 AD 的發病相關。包括神經遞質信號、尿素循環、天冬氨酸類谷氨酸代謝和谷胱甘肽合成的異常。（研究者將 ITG 組差異的主要結果在特定的生化途徑中）
1. 蛋氨酸循環 ITG 中 AD 組膽堿濃度較低（p=0.003)，SAM 濃度較高（p=0.005)。與 CN 相比，AD 海馬 /ERC 中 CHDH、BHMT2、SHMT1 和 MAT1A 基因表達增加，MTR、AHCY 和 MTHFD1 基因表達降低。
2. 轉硫法與谷胱甘肽合成 ITG 的 AD 患者半胱氨酸（P<0.001*) 和谷胱甘肽濃度（P<0.001*) 較高。與 CN 相比，AD 組海馬 /ERC 中轉硫和谷胱甘肽合成的酶調節因子基因表達存在差異。與 CN 相比，AD 組海馬 /ERC 區 CTH 和 GSS 基因表達降低。
3. 多胺的合成與分解代謝在 ITG 中的 AD 中觀察到較高濃度的亞精胺（P=0.004)。與 CN 相比，多胺分解代謝基因 SAT1 和 SMOX 表達增加，而多胺合成基因 SRM 和 ODC1 在海馬 / ERC 中表達降低。
4. 尿素循環 在 ITG 中，AD 中的 NAG(P<0.001*) 濃度較低。與 CN 相比，基因 ARG2，ASL，ASS1，OAT 和 ODC1 在 AD 的海馬 / ERC 中表達減少。
5. 谷氨酸 - 天冬氨酸代謝 在 ITG 中，AD 中的 NAA (P=0.002*) 濃度較低。與 CN 相比，AD 的 FH，MDH1，MDH2，GLS2 和 GOT2 基因在海馬 / ERC 中的表達降低。
6. 神經遞質代謝 ITG 中，AD 中的 GABA(P<0.001*) 濃度較低。與 CN 相比，AD 中海馬 / ERC 中 GABA 合成基因 SAT1 和 MAOB 的表達增加，而 GLS2 和 OAT 基因的表達降低。
圖 5 通過整合了六類生化反應的代謝物和基因表達結果，顯示了這些途徑如何在多個水平上交叉和潛在地相互作用，以影響 AD 病理和癥狀的嚴重程度。
圖 5 與轉甲基化和多胺合成 / 分解代謝相關的代謝途徑中代謝物濃度和基因表達變化的綜合總結
總結與局限性
本研究是利用 CE-MS 在腦組織樣本中應用靶向代謝組學結合基因表達分析來識別與 AD 的轉甲基化和多胺途徑相關的多個代謝網絡中的異常的研究。由于 ERC 和 HIP 組織樣本的可獲得性有限，代謝組學分析只能在基因表達與 ERC 和 HIP 相關的 ITG、MFG 和 CB 中進行的，具有一定的局限性，但是，結合代謝組學和轉錄組分析來繪制先驗特定的生化途徑，可能會為 AD 如何廣泛影響多條相互關聯的代謝途徑提供重要的見解。雖然樣本量較少，研究可能無法將結果外推到更大的人群，顯著的結果可能不能反映真正的效果，所以研究者用感興趣的代謝物指定了先驗假設，并實施了 FDR 和 Bonferroni 調整來控制多重比較，以減少潛在的偏差，值得考慮的是，在基于尸檢的神經退行性疾病（如 AD) 的評估中，一些觀察到的變化可能是與神經元丟失相關的終末事件的非特異性標志物。本研究發現的特異性值得在未來的研究中在其他神經退行性疾病中進行測試。細胞甲基化潛在的改變和轉甲基化途徑通量的增加，對抗氧化防御機制的需求增加，尿素循環和天冬氨酸 - 谷氨酸途徑的代謝紊亂，擾亂了線粒體生物能，增加了多胺的生物合成和分解，以及神經遞質代謝的異常，這與 AD 的病理嚴重程度和臨床癥狀的表現有關。它們說明了 AD 的輪廓是一種普遍存在的代謝紊亂，可能涉及多條相互關聯的代謝途徑的失調，每條代謝途徑都能夠觸發 AD 病理的積累和癥狀的演變。這項研究大大增加了對 AD 發病的代謝基礎的全面理解，并為疾病調整治療的新靶點提供了新視角。
參考文獻 Uma V. Mahajan, Vijay R. Varma,et al. Dysregulation of multiple metabolic networks related to brain transmethylation and polyamine pathways in Alzheimer disease: A targeted metabolomic and transcriptomic study. PLoS Med.2020; 17(1):e1003012. Epub2020/01/14
https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003012 PMID: 31978055
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